Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Zebra balığı bakımı, üreme ve burada açıklanan deneyler uygun olarak bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu vardır ve kurumsal hayvan refahı Komitesi tarafından Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, protokol onaylandı AWC-16-0127 numara. 1. büyüme ve Paramecia bakımından Canlı paramecia kültürler zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (ZIRC) gibi kaynaklardan elde edilir. Bir canlı büyüyen kültür, paramecia kültür, E. coli MG1655 Kültür (optik yoğunluk OD600 1.0-2.0) 1 1’de resuspended mL 1 mL ekleyin x E3 (0,29 g/M NaCl, 13 mg/L KCl, 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0,48 g/L HEPES, pH 7,0, steril) ve 8 mL 1 x E3 10 mL doku kültürü şişesi içine. Hafifçe girdap ve 22 ° C’de depolayın Bir kültür korumak için her iki haftada bir, bir 10 mL doku kültürü şişesi ile 9 mL taze 1 x E3 orta 10 içeren içine 1 mL paramecia kültür geçiş8 CFU/mL 1’resuspended E. coli MG1655 x E3. 2. bakteriyel doz zebra balığı için yönetilen tespiti Terliksi Hayvan içinde bakteri half-life belirlemekNot: Aşağıda açıklandığı gibi half-life bakteri paramecia içinde uygun E. coli amip, kurtarılan kaplama tarafından belirlenir. Paramecia ve bakteriyel ortak kültürün bir 50 mL konik tüp içine 2 h kuluçka bakteri (OD600 1.0) paramecia 22 ° c ile birleştirmek, paramecia 1 x E3 ve sayısı ile yıkama paramecia (aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi mililitre başına sayısı 3.2.7 ve 3.2.8). Paramecia sayılması sonra paramecia ve bakteriyel ortak kültür her saat (için 6 h sonrası pozlama) 50 µL kaldırın ve her örnek bir taze 1,5 mL tüp içine ekleyin. Yer 950 µL % 1 Nonyonik yüzey aktif, ( Tablo malzemelerigörmek) fosfat içinde serum fizyolojik (PBS) çözüm her 1,5 mL tüpler ve 1dk paramecia koşullar için girdap içine arabelleğe alınmış. 1:10 gerçekleştirmek bir eritici (yani, 900 µL içinde 100 µL) olarak steril PBS kullanarak her örneğinin dilutions. Her seyreltme seçici plakalar üzerine 100 µL plaka (LB tet Orta: 1 g/L tryptone, 30 µg/mL tetrasiklin 0.5 g/L maya ekstresi, 1 g/M NaCl) ve 16 h için 37 ° C’de kuluçkaya. Ertesi gün, say ve sadece izole ve farklı bireysel kolonileri sayarak bakteri kolonileri tabak (koloni oluşturan birimler, CFUs) kaydedin. Bir tabak 30-300 CFU verir bir seyreltme ile tanımlayın. Seyreltme belirlemek kullanılan çarpan. Bakteri kültürü 1 µL 99 mL steril PBS ile karıştırılır, örneğin, 1: 100 (0.01) seyreltme bu. Bu numara CFU sayısını seyreltme olacaktır. Aşağıda, hesaplama orijinal örnekteki CFU belirlemek için her zaman noktasının gerçekleştirin: Hesaplamak ve uygun E. colisayısı grafik/saat için karşılık gelen amip 3.3.1. adımda hesaplanan paramecia konsantrasyon kullanarak çekim sonrası ve yarı ömrü içinde paramecia (Şekil 1) belirlemek. CFU kullanarak hesaplamak numarası her zaman noktası için hesaplanan ve 3.3.1. adımda hesaplanan paramecia konsantrasyon kullanarak uygun E. coli karşı saat sonrası kuluçka x ekseni, y ekseni üzerinde Terliksi Hayvan başına sayısı grafiğini çizer. Half-life paramecia içinde belirlemek. Bakteriyel bakteriyel half-life dozaj ve yırtıcı oranı belirler.Not: Bakteriyel dozu belirlemek için paramecia içindeki bakterileri yarılanma ömrü ve zebra balığı paramecia üzerinde preying oranı (bkz. Adım 3.4) var dikkate alınması. Paramecia içinde bakteri çürüme belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:(1)N0 2 h kuluçka sonra bakteri paramecia başına ilk miktarı nerede, Nt zaman t sonra kalan miktar ise, τ sonra canlı bakteri sayısını yarıya zaman ise k çürümesine sabit. Bakteriyel half-life kullanarak çürümesine sabit k bozulması deneyden belirlemek (yani, saat sonra canlı bakteri/Terliksi Hayvan miktarını yarıya).(2)Half-life, tespiti için dönem ve(3) veya(4)Not: Şekil 1′ de, E. coli half-life paramecia içinde yaklaşık 2.3 h uyarlanmıştır. Böylece, formülü (4), çürüme oranı, k, E. coli için kullanmaktır:(5) Canlı bakteri (Nt) zebra balığı larva tarafından alınan doz bulmak için half-life deneme çürüme hızı (k) belirlemek preying oranı kadar veya saatte bir balık tarafından yemiş paramecia nerede (P) sonra preying zaman (t):(6) veya(7)Not: Şekil 1başına, 790 CFU bakteri paramecia (N0) 2 h kuluçka (t) sonra başına başlangıç miktarıdır. Film 1 ve Şekil 2preying (P) 1539 oranıdır. Bu değerleri kullanarak denklemi içine (7), ikame olarak 2 h kuluçka takip bir zebra balığı tarafından tüketilen bakteriyel dozaj hesaplamak için:(8) 3. gıda kaynaklı enfeksiyon zebra balığı Parameciaile bakteri kuluçkaya. Paramecia ve E. coli MG1655 ortak bir kültür gecesi öncesinde enfeksiyon hazırlayın. E3 medya 8 mL, 1 mL bir devam eden paramecia kültür ve bir E. coli MG1655 kültürünün 1 mL (OD600 = 1.0) 1’resuspended x E3 T25 doku kültürü şişeler içinde. Şişeler, oda sıcaklığında (RT) gecede kuluçkaya. Her tedavi koşul için paramecia iki şişe hazırlayın. Bakteriyel büyüme medya aşılamak (LB: 1 g/L tryptone, 0.5 g/L maya ekstresi, 1 g/M NaCl) bakteri enfeksiyöz gerilme ile bir tabak bireysel bir bakteriyel koloni seçerek bir steril aşılama döngü kullanarak. 37 ° C’de sıvı kültür kuluçkaya ve dakikada (devir/dakika) gecede 110 rotasyonlar, sallayarak bırakın.Not: Kişisel koruyucu donanım (bir laboratuvar kat ve eldiven) giyilmelidir ve biyogüvenlik seviye 2 imkanları enfeksiyöz ajanlar işlerken kullanılmalıdır. Ertesi gün, gecede kültür OD600 ölçmek. Ne zaman medya 11 mL resuspended 1 OD600 ulaşmak için gereken kültür hacmi hesaplamak. Paramecia adımında 3.1.2 Santrifüjü 6.000 x g 5 min için her şişeyi için bir birim, üzerinden bakterilerden hacmi hasat. Süpernatant atın ve bakteriyel Pelet E3 medya 1 mL resuspend. İsteğe bağlı olarak, önceden bakteri floresan bir boya ile leke. FM 4-64FX bakteriyel leke (5 mg/mL stok çözelti) 1 µL ekleyin. Tüp photobleaching korumak ve dönen bitti sıra RT, 15dk için kuluçkaya folyo ile kapak. 1 ile yıkayarak aşırı boya kaldırmak x E3: cips bakteri ile Santrifüjü 6.000 x g 1.5 dakika, sonra Pelet E3 medya 1 mL resuspend. Yıkama adımları iki kez yineleyin. Lekeli bakteri ile Santrifüjü 6.000 x g 5 dk. atmak için de süpernatant hasat ve bakteriyel Pelet E3 medya 1 mL resuspend. Bakteriyel süspansiyonlar 1 mL her taze paramecia iki şişe ekleyin. RT 2s için kuluçkaya.Not: Eğer lekeli bakteri ile çalışma, 2 h, RT karanlıkta kuluçkaya. Yıkama bakteri/paramecia ortak kültür. Her iki şişe paramecia/bakteri ortak kültür 50 mL konik tüp içine içeriklerini birleştirebilirler. 300 x g 10 dakika süreyle 15 ° C’de, santrifüj örnekleri santrifüje önce bu adımı önceden soğutulmuş olduğundan emin olun. Yaklaşık 10 mL serolojik pipet kullanarak E3 süpernatant kaldırmak ve yaklaşık 10 mL taze 1 eklemek için konik tüp x E3.Not: Tüm yıkama adımları sırasında paramecia Pelet dışarı yüzmeyi başlayacak gibi süpernatant, kaldırırken çok hızlı olmak esastır. Spin ve bu aşamada yeterince hızlı işleme emin olmak için bir zamandaki bir tüp süpernatant kaldırın ve paramecia içinde süpernatant kaybı olmaması. 5 dk. kaldırmak için yaklaşık 10 mL serolojik pipet kullanarak E3 süpernatant örnekleri üzerinden Santrifüjü 300 x g 15 ° c de spin ve yaklaşık 10 mL taze 1 eklemek için konik tüp x E3. Bu iki kez tekrarlayın. Santrifüj örnekleri, 300 x g 5 dakika süreyle 15 ° C’de yaklaşık 10 mL Pelet bozmaya değil dikkat çekici E3 süpernatant, kaldırın. Pelet E3 medya kalan 10 mL resuspend ve süspansiyon 500 µL yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Paramecia 500 µL 300 x g paramecia saymak 5 min için de centrifuging tarafından cips. E3 süpernatant 400 µL 500 µL örneğinden kaldırmak. Paramecia kalan 100 µL için 20 µL ,5 formaldehit çözüm ekleyin ve hafifçe resuspend ve 22 ° C’de 5 min için kuluçkayaNot: Bu adımı sayım için izin vermek için paramecia öldürür. Pipet ve kaydı kullanarak gerçek toplam hacim ölçmek. Paramecia süspansiyon 1:1 v/v %0,4 trypan mavi çözüm ile sulandırmak. Bir hücre sayaç veya hemasitometre ölü paramecia/mL saymak için kullanın.Not: Önceki fiksasyon adım, çoğu paramecia bu noktada ölmüş olacak, ancak bu numarasını yansıtacak yardımcı kuluçka deneme için canlı paramecia sayısı. Yazarlar önemli paramecia ölüm nedeniyle bakteri Co kuluçka, bulamadı, bu yüzden bu bir faktör olarak göz ardı. Paramecia ve zebra balığı larva Co kuluçkaya. Paramecia konsantrasyonu hesaplayın:Not: Bu hesaplama paramecia konsantrasyonu 50 mL konik Tüp 3.2.5 adımından verir. 2 x 105 paramecia/mL E3 3 mL nihai bir birimdeki bir konsantrasyon için gerekli yıkanmış paramecia hacmi hesaplamak.Not: Paramecia konsantrasyonu optimizasyonu tabi istenen bakteriyel dozajı göre ayarlanabilir. 6-şey plaka 3 mL taze E3 (adımda hesaplanan paramecia uygun konsantrasyonu içeren toplam hacmi içine her kuyuya 100 mM Tris pH değeri 100 mg/l Transfer 10 zebra balığı içinde 8.0 son konsantrasyonu tricaine ekleyerek zebra balığı anestezi 3.3.2). sıvı onlar yeniden elde etmek–dan alıcı iyi anestezi emin olmak için en az bir miktarda larva transfer etmek için emin olun. 30 ° c 2 h yırtıcı için en uygun yıldırımdan koşullar emin olmak için gün-ışık koşulları altında diurnal kuluçka için kuluçkaya. Zebra balığı balık bir yeni de içeren 3 100 mg/L tricaine her zaman içeren mL taze E3 transfer ederek en az 5 kez yıkayın.Not: Tricaine çamaşır adımı sırasında atlamak çalışmayın. Anestezi olmadan telefon larva transfer hayvan için sıkıntı ve zarar riskini artırır. İsteğe bağlı olarak, zebra balığı 3 mL % 1 düşük-melt özel bir siyah duvarlı 6-şey plaka zebra balığı gömerek görüntüleme için hazırlamak: düşük-melt özel 1xE3 içinde oluşan ve bir mikrodalga fırında ısıtılan. Erimiş bir kez, tricaine 160 mg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Sağda (Şekil 3) pozisyon balıktır uç, baş sola ve kuyruk üzerinde olduğundan emin yükleme kırpılmış bir jel kullanarak bir stereomicroscope altında. Özel ayarlamak 5 dakika bekleyin, sonra 1 x E3 içeren 160 mg/mL tricaine görüntüleme için katıştırılmış balıkla yerleşimi. Preying oranı belirler.Not: Hiçbir ayrı deney preying hızını belirlemek için ayarlanmış olması gerekir. Bunun yerine, bu adımı sırasında 3.3.4, aşağıda açıklandığı gibi yapılabilir. 3.3.4 adımı sırasında preying zebra balığı bir stereomicroscope ve yakalama video görüntüleri av yakalama üzerinde görüntüleyin. Video görüntüleri puan. Av yakalama zebra balığı av doğru çarpıcı tarafından karakterizedir. Bu sadece bir yaklaşım olmakla birlikte her grev bir av yakalama olay saymak ( konuyabakın). Av yakalama olay üzerinden birden çok video klipleri, saatte ortalama sayısı her bir farklı zebra balığı larva (Şekil 2) temsil eden hesaplayın.