Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

De therapie van het gen van de cel van de stam is een krachtig middel om aan te pakken van een breed scala van menselijke pathologie. De therapie van het gen van de HSPC is een bijzonder aantrekkelijk benadering, als gevolg van i) het relatieve gemak van het verzamelen van deze cellen van de patiënten, ii) de schat aan kennis die beschikbaar is met betrekking tot cel oppervlakte fenotypes en ex vivo cultuur parameters, en, als het veld groeit, omdat iii) het presenteert wetenschappers met een steeds groter wordende toolbox van gene wijziging strategieën die zijn toegesneden op de verschillende ziekten van belang. We zijn actief onderzoekt HSPC gene therapie benaderingen vanuit meerdere invalshoeken, met inbegrip van de fundamentele wetenschap van HSPC biologie, de engraftment van HSPCs gen gemodificeerde in preklinische in vivo modellen, en de toepassing op relevante patiënt populaties. Wij en anderen hebben gekenmerkt het fenotype cel oppervlakte van functioneel verschillende HSPC deelverzamelingen^1,2,3, de mobilisatie en de conditionering regimes die maximaliseren van de opbrengst van de HSPC en engraftment terwijl het minimaliseren van toxiciteit^4,5, en het gen wijziging en bewerken van gene strategieën die zijn aangepast aan een breed scala van kwaadaardige, genetische en infectieziekten^{6,7,8, 9,10}. De functie en de engraftment van HSPCs gen-gewijzigd kunnen worden geëvalueerd in een aantal kleine – en grote-dierlijke modellen, waaronder muizen, honden en NHPs. In het bijzonder zijn Waterprogramma modellen voordelig omdat vele reagentia, bijvoorbeeld antilichamen specifiek voor de HSPC cel oppervlakte eiwitten zoals CD34 en CD90, kunnen door elkaar worden gebruikt in mens en Waterprogramma cellen. Bovendien, in tegenstelling tot de muizen, grote dieren zoals NHPs toestaan een nauwere onderlinge aanpassing van de omvang van de genetische modificatie nodig zijn voor de klinische werkzaamheid. Ten slotte NHPs zijn de gouden standaard voor het modelleren van menselijke aandoeningen zoals HIV-1 infectie¹¹ en een opkomende modelsysteem voor kandidaat-antikanker en anti-HIV immuuntherapie^12,13.

Het doel van dit protocol is te schetsen van de methoden voor het zuiveren, genetisch te wijzigen, en het voorbereiden van NHP HSPC infusie producten. Hoewel buiten het toepassingsgebied van dit protocol, wij hebben eerder aangetoond dat deze producten in autologe Waterprogramma hosts engraft, aanleiding geven tot alle hematopoietische geslachten, en therapeutische werking in een brede waaier van ziekte modellen¹. Wij hebben ook gekenmerkt van de tentiemechanismen van enten HSPCs en bouwde een platform voor het bijhouden van de kinetiek, mensenhandel en fenotype van individuele HSPCs en hun nakomelingen, volgende autologe transplantatie^1,14. De hier gepresenteerde methoden zijn ontwikkeld met de volgende doelstellingen: i) te isoleren van zeer zuivere HSPCs en lange termijn enten HSC deelverzamelingen, ii) om te houden van de primitieve HSCs tijdens ex vivo cultuur, en iii) bij het efficiënt gen-wijzig beide bulk HSPCs of lange termijn enten HSC deelverzamelingen. We gebruiken magnetische-bijgewoonde (MACS), cel-Sorteren en fluorescentie-activated cell sorting (FACS), om te isoleren van de fenotypische/functioneel verschillende HSPC populaties, consistent met de methoden van vele groepen^{2,15, 16}. Het onderhoud van primitieve HSCs in cultuur (dat wil zeggen, het minimaliseren van de differentiatie van deze cellen in gepleegd progenitoren die aanleiding tot volledig geven gedifferentieerde lymfoïde en myeloïde subsets) is een essentieel aspect van het protocol beschreven hier. Hoewel we eerder benaderingen om te vouwen HSPCs gekenmerkt hebben met behoud van een primitieve fenotype^17,18, hier beschrijven we een protocol dat is gericht op het behoud van de HSCs via een minimale (48 uur) en gedefinieerd ex vivo cultuur.

De efficiënte wijziging van HSPCs en HSC deelverzamelingen is een centrale doelstelling van dit protocol. Verschillende benaderingen hebben we gemeld, twee behoren tot verreweg het meest onderzocht in klinische proeven: LV-gemedieerde genetische modificatie en nuclease-gemedieerde gene bewerken van^1,6,19. Bewerken van Gene strategieën gebruikt u een van een aantal nuclease platformen specifiek wijzigen een gerichte gen van belang, bijvoorbeeld, C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) voor de behandeling van HIV-infectie^7,19 of Bcl11A voor de behandeling Hemoglobinopathieën⁶. Hier, richten we ons op LV-gemedieerde genetische modificatie, waarin transgene lading semirandomly in het genoom^{1,8,20 integreren}. Een belangrijk voordeel van LV benaderingen is de mogelijkheid om grote hoeveelheden van genetisch materiaal (tot 8 of 9 kilobases) leveren. Hoewel bewerken van gene strategieën worden ontwikkeld te richten op een transgenic van belang om te integreren alleen op een opgegeven locus door donor van homologe recombinatie (HDR), vereisen deze methoden verdere ontwikkeling in vitro en in kleine dierlijke modellen. In tegenstelling, hebben LV vectoren is gebruikt uitgebreid in NHPs en patiënten^21,22. Nog belangrijker is, kan het protocol hier beschreven, die gebruik maakt primer BM als startende HSPC bron, gemakkelijk en in grote lijnen aangepast worden, bijvoorbeeld isoleren van PBSCs. Zoals hierboven beschreven, is we profiteren van de hoge mate van genetische gelijkenis tussen NHPs en mens te gebruiken reagentia die voor beide soorten gelden. Ten slotte, deze benadering is aangepast om aan te passen andere hematopoietische deelverzamelingen, namelijk T cellen^12,23,24; de komst van doeltreffend T-cel immunotherapie benaderingen heeft leunde zwaar op hetzelfde platform LV die in dit protocol wordt gebruikt. Deze methoden zijn geschikt voor elke onderzoeker kochten HSPC biologie of LV-gemedieerde genetische modificatie. Bijvoorbeeld, de HSPC zuivering protocol hier gepresenteerd kan worden gebruikt te karakteriseren roman HSC-verrijkt deelverzamelingen, zoals eerder beschreven van^1,15,25. Ook worden de LV transductie methoden hier gepresenteerd ook kunnen toegepast en verder ontwikkeld voor talloze andere celtypes en experimentele vragen, zowel in in vitro en in vivo modellen.

Kortom presenteren we methoden om te isoleren en Waterprogramma HSPCs genetisch te wijzigen. Deze methoden kunnen gemakkelijk aan te passen voor andere soorten en andere bronnen van HSPCs. Dit grondig doorgelicht protocol toont grote belofte in de modellering van de effectieve therapieën voor talrijke ziekten bij de mens.