Forberedelse og gen modifikation af ikkemenneske primat hæmatopoietisk stamceller og stamceller

Stem cell genterapi er et effektivt middel til at løse en bred vifte af menneskelige patologier. HSPC genterapi er et særligt attraktivt tilgang, på grund af i) den relative lethed indsamle disse celler fra patienter, ii) rigdommen af viden, der er tilgængelig om celle overflade fænotyper og ex vivo kultur parametre, og udvider sig som feltet, fordi iii) det præsenterer forskere med en stigende værktøjskasse af genet ændring strategier skræddersyet til forskellige sygdomme af interesse. Vi undersøger aktivt HSPC gen terapi metoder fra flere vinkler, herunder de grundlæggende videnskab HSPC biologi, engraftment af gen-modificerede HSPCs i prækliniske undersøgelser in vivo modeller og ansøgning til relevante patientgrupper. Vi og andre har præget den celle overflade Fænotypen af funktionelt adskilte HSPC delmængder^1,2,3, mobilisering og conditioning regimer, at Maksimer HSPC udbytte og engraftment samtidig minimere toksicitet^4,5, og genet ændring og gen-redigering strategier, der er skræddersyet til en bred vifte af ondartede, genetiske og infektionssygdomme^{6,7,8, 9,10}. Funktion og engraftment af gen-modificerede HSPCs kan evalueres i et antal små – og store-dyr modeller, herunder mus, hunde og primaterne. Især er PHN modeller fordelagtig, fordi mange reagenser, for eksempel antistoffer specifikke for HSPC celle overflade proteiner som CD34 og CD90, kan blive brugt i flæng i menneskelige og NHP celler. Desuden, i modsætning til mus, store dyr som primaterne tillade et tættere indbyrdes tilnærmelse af omfanget af gen ændring nødvendig for klinisk effekt. Endelig primaterne er guld standard for modellering af menneskers sygdomme såsom HIV-1 infektion¹¹ og er en spirende modelsystem for kandidat anticancer og anti-HIV immunoterapi^12,13.

Formålet med denne protokol er at skitsere metoder til rensning, genetisk ændring, og tilbereder NHP HSPC infusion produkter. Selv om uden for anvendelsesområdet for denne protokol, har vi tidligere vist at disse produkter indpode autolog PHN hosts, give anledning til alle hæmatopoietisk lineages og give terapeutisk virkning i en bred vifte af sygdom modeller¹. Vi har også præget clonality af engrafting HSPCs og bygget en platform for at spore kinetik, menneskehandel og fænotype af individuelle HSPCs og deres afkom, følgende autolog transplantation^1,14. De metoder, der præsenteres her er blevet udviklet med følgende mål: i) at isolere meget rene HSPCs og langsigtede engrafting HSC delmængder, ii) at opretholde primitive HSCs under ex vivo kultur, og iii) til effektivt gen-ændre enten bulk HSPCs eller langsigtede engrafting HSC undersæt. Vi ansætter magnetisk-assisteret celle sortering (MLA), samt fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), for at isolere fænotype/funktionelt adskilte HSPC befolkninger, i overensstemmelse med metoderne, der af mange grupper^{2,15, 16}. Vedligeholdelse af primitive HSCs i kultur (dvs., minimere differentieringen af disse celler i engageret progenitorceller, som giver anledning til fuldt differentierede lymfoide og myeloide delmængder) er en vigtig facet af den protokol, der er beskrevet her. Selv om vi har tidligere karakteriseret tilgange for at udvide HSPCs samtidig bevare en primitiv fænotype^17,18, her, beskriver vi en protokol, der fokuserer på at fastholde HSCs via en minimal (48 h) og defineret ex vivo kultur.

Den effektive ændring af HSPCs og HSC delmængder er et centralt mål i denne protokol. Blandt flere metoder vi har rapporteret, to er langt de mest undersøgte i kliniske forsøg: LV-medieret gen ændring og nukleasen-medieret gen redigering^1,6,19. Gen-redigering strategier bruger en af en række nukleasen platforme specifikt ændre en målrettet gen af interesse, for eksempel, C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) til behandling af HIV infektion^7,19 eller Bcl11A til behandling af hemoglobinopathies⁶. Her fokuserer vi på LV-medieret gen ændring, hvor transgene ladninger integrere semirandomly i genom^1,8,20. En vigtig fordel af LV tilgange er evnen til at levere store mængder af genetisk materiale (op til 8 eller 9 kilobases). Selv om redigering af genet strategier udvikles for at målrette en transgen af interesse at integrere kun på en bestemt locus af homologe donor rekombination (HDR), kræver disse metoder yderligere udvikling af in vitro og i små dyremodeller. Derimod har LV vektorer været brugt i udstrakt grad i primaterne og patienter^21,22. Vigtigere, kan protokollen beskrevet her, som benytter primet BM som udgangspunkt HSPC kilde, nemt og generelt tilpasses, for eksempel, for at isolere PBSCs. Som beskrevet ovenfor, drage vi fordel af den høje grad af genetisk lighed mellem primaterne og mennesker at bruge reagenser, der anvendes til begge arter. Endelig, denne tilgang er blevet tilpasset for at ændre andre hæmatopoietisk delmængder, nemlig T celler^12,23,24; fremkomsten af virkningsfuldt T-celle immunterapi tilgange har påberåbt sig stærkt samme LV platformen udnyttes i denne protokol. Disse metoder er hensigtsmæssige for enhver interesseret i enten HSPC biologi eller LV-medieret gen ændring forsker. For eksempel, HSPC rensning protokollen præsenteres her kunne bruges til at karakterisere romanen HSC-beriget delmængder, som tidligere beskrevet^1,15,25. Ligeledes, LV transduktion metoder præsenteres her kunne ligeledes anvendes og yderligere udviklet til talrige andre celletyper og eksperimenterende spørgsmål, både i in vitro- og in vivo modeller.

I sammendrag præsenterer vi metoder for at isolere og genetisk ændre PHN HSPCs. Disse metoder kan være let tilpasses til andre arter og andre kilder til HSPCs. Denne grundigt undersøgt protokollen viser meget lovende i modellering af effektive behandlinger for mange menneskelige sygdomme.