השתלת איון עם פגיעה אינטרה באמצעות h-עם פגיעה מטריקס איון מילוי (יונת)
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאימות ויוו של טיפול מבוסס הידרוג תא, שממחישים את הדוגמה של השתלת איון. h-עם פגיעה איון מטריקס ממלאת השרשה (ביות) מאפשר השתלה של תערובת תא-הידרוג בין השכבות עם פגיעה, ליד כלי הדם, כדי למקסם את engraftment בסביבה מטבולי תקין.
Abstract
רפואה רגנרטיבית המבוסס על טיפול בתאי מייצג תקווה חדשה לריפוי המחלה. מכשולים הנוכחי כוללים נאות ויוו אימות של היעילות של הטיפול. העברה אל הגוף הנמען, תאים בדרך כלל צריכים להיות משולב עם biomaterials, במיוחד hydrogels. עם זאת, אימות יעילות של שתל כזה דורש הסביבה המתאימה את הידרוג נכון, האתר נכון הנמען. Omentum עשוי להיות אתר כזה. בהתבסס על הדוגמה של השתלת איון, פיתחנו את הטכניקה (מילוי איון מטריקס עם פגיעה-h) ביות, אשר מורכב של ההזרקה של השתל בתוך הרקמה, בין השכבות עם פגיעה, כדי לשפר את ההשתלה איון והישרדות. כדי להשיג זאת, איונים צריך להיות מוטבעת של הידרוג עם צמיגות המאפשרת שלה הזרקת באמצעות מחט של atraumatic. מזרקים נטענים עם שילוב של הידרוג איונים. מספר ההזרקה מתבצעת בתוך הרקמה עם פגיעה בנקודות כניסה שונים, בתצהיר של התערובת איון/הידרוג נעשית לאורך קו. . בדקנו את הכדאיות של גישה זו חדשניים באמצעות חרוזים לתוספי- החרוזים היו להתפשט ברחבי הרקמה עם פגיעה, בסמיכות לכלי הדם. כדי לבדוק את היעילות של השתל, אנו הושתלו איונים עכברים סוכרתיים, לבצע מעקב מטבולית מעל חודשיים. המושתלים איונים הציג שיעור גבוה של vascularization מחדש סביב ובתוך איונים, וביטל סוכרת. הטכניקה ביות יכול להיות ישימים עבור סוגים אחרים של טיפול הידרוג או תא, עבור תאים עם פעילות מטבולית גבוהה.
Introduction
טיפול בתאי הוא נושא חם, כפי שהוא שואף לרפא מחלות בהתבסס על רפואה רגנרטיבית. תא בסיוע חומר ביולוגי טיפולים יותר ויותר נחקרו בשנים האחרונות, בעיקר משום תא השרשה לעיתים קרובות דורשת נשאית עבור העברת תאים מן המנה תרבות אל הנמען. פיגומים biomaterial מעבירות תא ערך פוטנציאלי זה למלא את תפקידי מספר1. נשאית המוסמכת צריך להגן על תאים מפני מכני מדגישה ומספקים תנאים צמיחה חיובית, כגון גורמי גדילה החיוניים, והוצאת פסולת מטבולית, חילופי חומרים תזונתיים, חמצן2.
בין הסוגים השונים של biomaterials להשתמש בטיפול תא, hydrogels יש יתרונות רבים. הם מסתיימים, מתכלה, קל לטפל ולהקל דיפוזיה חמצן3. יתר על כן, הטכנולוגיה הנוכחית מאפשרת את השימוש hydrogels כדי לעזור תאים לשרוד ו- engraft עם, למשל, תוספי עם גורמי גדילה או מטריצה במיוחד הסלולר חלבונים4.
יכול להיות מוזרק נושאות הידרוג המכיל תאי גזע כמו טיפולים, , למשל, עצם התחדשות5 ומערכת העצבים המחלה6. ההשתלה של תאים סמויה פעיל נדרש. בזמן אימות במבחנה של הגישה אפשרית, כלים וטכניקות עבור אימות ויוו להישאר להיות מעודן.
השתלת תאים, הידרוג יכול בקלות להתבצע על ידי זריקה תת עורית כאשר הביו הבדיקות נערכות. עם זאת, כאשר תאי המושתל נועדו להסדיר גורמים מערכתית על-ידי פעולת חילוף החומרים שלהם, לוקליזציה תת עורית זו אינה אופטימלית, בעיקרו של דבר מבחינת ניקוז ורידי7. לכן, אין כלים הנוכחי כדי במהירות, בבטחה וביעילות להעריך את ההשפעות המיטיבות של הידרוג. מבוסס על הדוגמה של השתלת איון, הדורש כי ההורמונים להשתחרר למחזור הדם של השתל בתגובה רמות הגלוקוז בדם, פיתחנו שיטה חדשה להשתלה תא/הידרוג ויוו.
הצעד הראשון היה לזהות אתר השתלת מקבל, אשר יכול לקבל של הידרוג עם תאים. Omentum מציע שטח גדול עבור ההשתלה, הוא מאוד פלסטיק, שלה vascularization צפופה בשילוב עם הגדרת בקרום הבטן היא מעניין ללמוד שיש פעילות מטבולית גבוהה8תאים. אנחנו הבא צריך לבסס טכניקה כירורגית המאפשר ההעברה של התאים, את הידרוג לתוך omentum. בהשראת lipofilling המשמשים לניתוח פלסטי9, פיתחנו את איון מטריקס עם פגיעה h מילוי הגישה (ביות). איונים נעוץ הידרוג מוזרקים בתוך הרקמה עם פגיעה. הטכניקה נועד גם כדי לספק engraftment המרבי על ידי ניצול התצהירים מרובים של תערובת התא ואת הידרוג לתוך הרקמה עם פגיעה, שבו מספר רב של כלי דם גם משפר שתל חמצון.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים טכניקה פשוטה וחדשני עבור איון השרשה בין הסדינים עם פגיעה, בתוך רקמת השומן הקרוב ביותר בכלי הדם. זה מורכב של ניתוח מיקרו פולשנית, אשר יכול להסתיים תחת לפרוסקופיה, עם ההזרקה של איים הכלול של הידרוג לתוך רקמת השומן. טכניקה זו ישימה בקלות על כל השילובים הידרוג ותא צריכה להיבחן סביבה תפקודית סמויה.
Protocol
Representative Results
Discussion
יכול להיות מודגשות כמה צעדים קריטיים פרוטוקול זה. ראשית, על האדם ביצוע הניתוח וטיפול ברקמות להיות עדינים עם רקמת השומן, כפי שהוא שביר. ריסוק או פגיעה omentum את צריכה להימנע. Omentum, כמו טישו הגנתית, מועשר מקרופאגים, לויקוציטים אחרים. אלה תאים חיסוניים יכול להיות מופעל על ידי מניפולציה מופרז, יכול להשפיע לרעה על השתל. שנית, שתל (איון-הידרוג תערובת) טוען גם הוא קריטי. האדם ביצוע ההליך חייב להימנע מתה אמצעי אחסון, עליך לטעון את כל התערובת הידרוג-איון לתוך המכשיר הזרקת. מיד לאחר שלב זה, נקודה קריטית נוספת היא הזריקה עצמה. הזרקת חייב להתבצע לאט, בזהירות, בעדינות. המזרק חייב יבוצע ריקון מאת הידרוג ריק טעון בתחילה כדי לאחזר כל איונים הנותרים. שלישית, תפירת חייב להיעשות בזהירות, בשני שלבים. התוכנית שרירים צריך להיות sutured קודם, מקפיד לא תפר את omentum לשריר, העור צריך להיות sutured בנפרד. לגבי ההליך explantation עבור השתל עם פגיעה, תשומת לב מיוחדת יש לנקוט באותו הרגע כאשר העורקים קרוב לבטן (gastroepiploic העורקים) הם חרות. חשוב להקדיש תשומת לב כל שטפי דם זה להתרחש ולעצור אותם לפני תפירת החיה, כמו רמזים דימום מתמשך למוות בעלי חיים בתוך ימים אחדים.
פתרון בעיות עשוי להיות נחוץ לגבי המדיום להובלת איונים; הבחירה של הידרוג היא עד הנסיין, כל עוד הידרוג להזרקה. השימוש של חומרים שונים יכולים לגרום משתנה להשתיל פונקציה (עם או בלי תוספת, לדוגמה). השיטה המתוארת כאן הוכיחה את יעילותה אינרטי חומר השתלה במשותף עם יחס איון 7660 IEQ/ק ג.
השיטה הנוכחית עלולים להגביל את גודל עם פגיעה והמאפיינים הידרוג. כדי להשתמש מודל מכרסמים סוכרתית, טיפול אינסולין הוא חובה לפני ההשתלה איון לספק מספיק אזור הרכבה. מכרסמים סוכרת לאבד הרבה משקל ומסה שומן עקב סוכרת STZ-induced. בהתחשב המשקל קטן של החיות שהשתתפו במחקר זה, הרכבה בשטח קטן אפילו אינה אפשרית.
שימור ניהול תקין גליקמיה (לפני ההשתלה באמצעות כדורי ושימוש לאחר מכן אינסולין ארוך) הוא חובה. כאן בחרנו לשמר בגדר אינסולין עד היום של השתלת מכמה סיבות. ראשית, שמירה על פקד גליקמי תקין במידה ניכרת מפחית סטרס חמצוני המושרה על ידי סוכרת באיברים הנמען, אשר עלולות להזיק השתלת איון11 ומאפשרת המשך טיפול אינטנסיבי אינסולין, חתן הכנה שנצפתה מרפאת12. שנית, רצינו להגביל את המספר המרבי של הרדמה הליכי העכברושים. בנוגע המימוש של אינסולין טיפול במהלך ההמשך מטבולית באמצעות אינסולין ארוך, נמנע ערכת שימוש מסיבי סיבוכים בשל glucotoxicity (אשר יכול להרוס את שתלי), כדי לשמר את ערך גליקמיה “אמיתי”.
כדי לפקח על יעילות שתל, גליקמיה אינה פרמטר רלוונטי בימים הראשונים אם חולדות מקבלים טיפול אינסולין באמצעות כדורי. לכן בדיקת רמת C-פפטיד מוקדמת מספר פעמים השתלה היא חובה. בזמנים אלה כוללים את תחילת המחקר, לבחירת חיות לאחר ההזרקה STZ, אז רק שלפני ההשתלה, כדי להבטיח כי חולדות יישארו סוכרתית התחדשות הוא מינימלי.
הידרוג מאפיינים חשובים אף הם. הידרוג נוזל ידלוף החוצה עם פגיעה ברקמות, הידרוג בעלי צמיגות גבוהה לא יהיה להזרקה. צמיגות הידרוג ו- injectability יש להיבדק לפני השימוש, אך נראה חיוני כדי לבדוק גם את החומר ישירות על ידי הערכה של איון או אחר הישרדות התאים במבחנה. כאן, כמו איים קטנים רגישים מאד והתקפת השימוש נשאית בעלי צמיגות גבוהה יכול להשפיע דיפוזיה חמצן.
מבחינת החשיבות של השיטה המתוארת כאן לגבי שיטות קיימות, טכניקה זו השתלת רקמה אינטרה יתרונות לטווח של הפארמצבטית. זה גם atraumatic על הרקמה, בגלל מיקומו במיוחד כלי הדם, מונע סיכונים מערכת הקרישה שלו. גם, כאשר שוקלים השתלת איון, תגובה דלקתית בתיווך דם מיידית הוא התחמק14. יתר על כן, יונת מאפשר משתילים איונים לתוך איבר שאינם חיוניים, בניגוד השתלת לתוך הכבד, אשר מהווה סיכון מבחינת תפקוד הכבד15.
כדי להפיק ביצועים מיטביים, הידרוג חייב להיות מותאם התאים שזה ישא. השימוש של גורמי גדילה או חלבונים ספציפיים יכולה להיות השפעה חיובית על התאים המושתלים16,17.
לסיכום, טכניקה זו ניתן להשתמש לצורך אימות ויוו הידרוג על סוגי תאים שונים, בעיקר כאשר נדרשת סביבה חילוף החומרים הפעילים, באשר איונים. בנוסף, טכניקה כירורגית זו ישימה על יישומים מרובים, יכול להיות, בעתיד, במהירות ניתן להעברה לבני אדם, כמו זה ניתן בקלות לבצע באמצעות לפרוסקופיה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי Région אלזס, Biovalley אלזס BioArtMAtrix-Pôle-CQDM; 53/14/C1. המחברים מודים לצוות של pr. Bruant-Rodier מן Hôpitaux Universitaires דה שטרסבורג עוזר לפתח טכניקה חדשנית זו.
Materials
| Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
| Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
| CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
| C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
| Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
| Ethilon 4/0isoflo | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
| Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
| Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
| Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
| Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
| NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
| Needle 26G | TERUMO | 050101B | |
| Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
| Pentobarbital sodique | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
| Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
| Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
| Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
| Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |
References
- Bakhshandeh, B., et al. Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials. Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
- Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. Hydrogels in regenerative medicine. Adv Mater. , 3307-3329 (2009).
- Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).
- Bai, X., et al. Bioactive hydrogels for bone regeneration. Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).
- Allbright, K. O., et al. Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration. Muscle Nerve. , (2018).
- Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation. Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).
- Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum. Circ Res. 41, 380-390 (1977).
- Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F. The breast of the adolescent girl. Ann Chir Plast Esthet. 61, 629-639 (2016).
- Schaschkow, A., et al. Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier. Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).
- Schaschkow, A., et al. Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model. Journal of diabetes research. 2016, 8310516 (2016).
- Schaschkow, A., et al. Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome. Biomaterials. 52, 180-188 (2015).
- Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study. Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).
- Leitao, C. B., et al. Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival. Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).
- Narang, A. S., Mahato, R. I. Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation. Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).
- Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. Hydrogels as carriers for stem cell transplantation. IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).
