قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

يتم عادة الحصول على معلومات حول آليات الإنزيم وحركية على مستوى الفرقة أو ماكروسكالي مع السكان الإنزيم بالآلاف إلى ملايين جزيئات، التي تمثل فيها القياسات متوسط الإحصائي. ومن المعروف، بيد أن الجزيئات المعقدة مثل الإنزيمات قد تثبت عدم التجانس في سلوكهم والآليات الجزيئية التي لوحظ على مستوى فرقة ليست بالضرورة صالحة لكل جزيء. قد تأكدت هذه الانحرافات بمقياس جزيء الفردية على نطاق واسع بدراسات للإنزيمات واحد مع مجموعة متنوعة من أساليب الناشئة خلال العقدين الماضيين الماضي¹. جدير بالذكر أن الأسفار الكشف عن نشاط إنزيم الفردية قد استخدمت للتحقيق في عدم تجانس الإنزيمات النشاط^2،3 أو اكتشاف تأثير ما يسمى الذاكرة (فترات من نشاط الإنزيمات عالية نجح خلال فترات انخفاض النشاط و العكس)^4،5.

تتطلب العديد من الدراسات إنزيم واحد أن الإنزيمات هي معطلة على السطح أو ثابت مكانياً في طريقة أخرى للبقاء طويلاً بما فيه الكفاية في مجال الرؤية للمراقبة المستمرة. لقد ثبت تغليف الإنزيم في الدهنية لتمكين التثبيت الإنزيم مع منع أي تأثير سلبي الواجب السطح-إنزيم أو بروتين-بروتين تفاعلات^6،7. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم الدهنية إمكانية فريدة لدراسة البروتينات غشاء مفرد في بهم الدهن الطبيعية البيئة bilayer^8،،من⁹¹⁰.

فئة من بروتينات الغشاء، الناقلين، يمارس إزفاء اتجاهي للمواد عبر غشاء الخلية، سلوك الذي يمكن دراستها إلا عندما يتم تشكيل البروتينات في دهن بليرس (مثلاً، الدهنية)^{11، ،}من ¹²¹³. على سبيل المثال، إزفاء بروتون، تعرض بواسطة إنزيمات عدة سلاسل النقل الإلكترون بدائية وحقيقية النواة، دوراً هاما في التنفس الخلوي إنشاء قوة الدافع البروتون المستخدمة لتركيب ATP. وفي هذه الحالة، يقترن البروتون ضخ نشاط لنقل الإلكترون، على الرغم من أن إليه مفصلة لهذه العملية غالباً ما زال بعيد المنال.

في الآونة الأخيرة، أثبتنا إمكانية الكشف الفلورسنت زوجين مع كهربية لدراسة بروتون ضخ نشاط الإنزيمات واحد من أوكسيديز أوبيكوينول المحطة الطرفية من الإشريكيّة القولونية (الفسفرة بو₃) أعيد تشكيلها في الدهنية¹⁴. وقد تحقق ذلك بتغليف صبغة الفلورسنت غشاء كتيمة حساسة لدرجة الحموضة في التجويف الدهنية أعدت من هاء القولونية القطبية الدهون (الشكل 1A). وكان الأمثل كمية البروتين حيث أن معظم الدهنية الواردة أما جزيء الإنزيم المعاد تشكيلها لا أو واحد فقط (حسب توزيع Poisson). وقدمت ركائز اثنين من الفسفرة بو₃ بإضافة أوبيكوينوني إلى المزيج المادة الدهنية التي تشكلت في الدهنية والأكسجين (المحيط) في حل. ثم هي تمتز الدهنية قليلة على مسرى الذهب فائقة على نحو سلس شبه شفافة، مغطاة تجميعها ذاتيا أحادي الطبقة من 6-ميركابتوهيكسانول. وأخيراً، شنت مسرى على الجزء السفلي من الخلية سبيكترويليكتروكهيميكال بسيطة (الشكل 1B). يسمح التحكم الكهروكيميائية الدولة الأكسدة تجمع كينون أحد مرونة تحريك أو إيقاف التفاعل الأنزيمي في أي لحظة، بينما يستخدم لرصد تغيرات درجة الحموضة داخل التجويف الدهنية نتيجة إزفاء بروتون بصبغة حساسة لدرجة الحموضة الإنزيمات. قبل استخدام يمكن تحديد كثافة fluorescence صبغة الفلورسنت وثانيا، ربط دهني، حجم وحجم الدهنية الفردية وبالتالي التحديد الكمي للبروتون الإنزيم ضخ النشاط. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا لا سيما أن الفسفرة بو₃ جزيئات قادرون على الدخول في حالة تسرب عفوية سرعة تبدد القوة الدافعة بروتون. والهدف من هذه المادة إدخال تقنية القياسات الحويصلية واحد بالتفصيل.