Colletotrichum fioriniae פיתוח מים ותמציות פרחים מבוסס כלורופורם אוכמניות, חמוציות
Summary
. הנה, מתוארים bioassays שנועד לעקוב אחר ההתפתחות של חיידקים פטריות, Colletotrichum fioriniae, בנוכחות תמציות פרחים עם אוכמניות או חמוציות על coverslips זכוכית דקה. מים, כלורופורם- ו שדה מי גשמים – מבוסס פרחוני מיצוי טכניקות מפורטים כמו גם תובנה איך המידע הזה יכול להיות מיושם.
Abstract
לעקוב במדויק את פנולוגיה של תקופת פריחה ואת הדינמיקה הטמפורלי של סימנים כימיים פרחוני פטרייתי פירות רקובים פתוגנים, שיטות הפקת פרחוני ו- coverslip bioassays פותחו ניצול Colletotrichum fioriniae. אוכמניות, חמוציות, זה פתוגן נשלטת בצורה אופטימלית על ידי יישום קוטלי פטריות במהלך תקופת פריחה בגלל משחק התפקידים פרחים בשלבים הראשונים של זיהום. פרוטוקול מפורט כאן מתאר איך פרחוני תמציות (FE) התקבלו באמצעות מים, כלורופורם- ושיטות שדה מבוססת על מי גשמים לשימוש מאוחר יותר ב- bioassays coverslip זכוכית המתאימים. כל FE שימש כדי לספק ערכה שונה של מידע: התגובה של fioriniae ג כימי פרחוני גויסו רמזים במים (על בסיס מים), פתוגן התגובה פרח פרי שעוות משטח (מבוסס על כלורופורם) ושל שדה מבוסס ניטור של אספו פרחים מי גשמים, עוברים במבחנה תצפיות סביבה חקלאית. פה בהרחבה מתואר כמו גם או כלורופורם-על בסיס מים, עם bioassay המתאימה המתוארת שפיצתה ההבדלים הטבועים בין שני החומרים האלה. מי גשמים זה ברחה פרחים נאספה במכשירים ייחודי עבור כל יבול, המאזכרים הגמישות ואת יישום של גישה זו עבור מערכות חיתוך אחרות. Bioassays מהירה, זולה, פשוטה, ומספקים את היכולת להפיק ייתכן בייעודי לאתר מידע על הנוכחות של תרכובות פרחוני מופחתים ממקורות שונים. מידע זה בסופו של דבר מוטב יעדכן אסטרטגיות ניהול המחלה, כפי FE לקצר את הזמן הדרוש עבור זיהום להתרחש, ובכך לספק תובנה שינוי הסיכונים לזיהום הפתוגן במהלך עונת הצמיחה.
Introduction
Colletotrichum fioriniae גורמת פירות הריקבון Highbush אוכמניות (Vaccinium corymbosum ל’) והן את1,גדול אמריקאי חמוציות (נ’ macrocarpon ואיתן)2. הפתוגן הזה היה מותווה לאחרונה acutatum ג מינים מורכבות3,4,5,6 , הוא סוכן סיבתי של אוכמניות anthracnose וחבר הריקבון פרי החמוציות מורכבות, מעורר רבים אחרים צמח מחלות ברחבי העולם7. Fioriniae ג יש רדומים, hemibiotrophic סגנון חיים8, עם זיהומים המתרחשים במהלך בלום ופיתוח סימפטום לא הופך להיות לכאורה עד הפרי נמצאים בשלבים הסופיים של התבגרות9. אוכמניות, חמוציות, פירות רוט נשלטת רק בצורה הולמת עם פטריות יישומים שנעשו במהלך תקופת פריחה. המחלה overwinters אוכמניות רדום באד פרחוני סולמות10 , sporulates במהלך בלום. Conidia מועברים במהלך החופה באמצעות גשם-splash פיזור11,12 , הצטברות inoculum יש כבר בקורלציה חריפה תקופה פריחה13. תגובתה של מינים Colletotrichum פרחים המארח אינה ייחודית Vaccinium, כמו פרחים חשובים מרכיבי פוסט הדר בלום פירות טיפה (PFD)14 , כמו גם anthracnose תות15, בשני המקרים הגורם המחלה כדי sporulate. לכל המקרים הללו מדגישות את הצורך בשיטות יעילות להעריך את הדינמיקה הטמפורלי של רמזים כימי פרחוני על fioriniae ג ו פתוגנים אחרים הפוגעים במהלך בלום. התובנות שמספקת בשיטות המתוארות כאן הופכים להיות יותר ויותר יקר יותר.
פרוטוקול זה מפרט שיטות רכש תמצית פרחים (FE) ומנחה הערכת התגובות fioriniae כ FE דרך זכוכית coverslip bioassays15,16. טכניקות החילוץ פרחוני מחולקות לשני סוגים עיקריים; עקירות על בסיס מים (פעיל-FE, פסיבי (pass –FE), ולא שדה מבוססת על מי גשמים (rw-FE)), והשאיבה17 מבוססי כלורופורם (ch-FE). הקוד שיחולץ על בסיס מים מאפשרים בדיקה של מים גייסה סימנים כימיים פרחוני. אלו רמזים גויסו הם מרכיבים חשובים עשוי בית המשפט זיהום, מאז FE מגדיל מאוד את המהירות של זיהום16, בנוסף לספק את הלחות הדרושה הזיהום להתרחש. בנוסף, הם מייצגים מצב טבעי יותר כמו גירוי פרחוני יכולים להישטף לאורך החופה במהלך הרטבה-אירועים כפי שנצפו בעבר אוכמניות,14,אחרים מערכות חיתוך16. עקירות פרחוני מבוסס כלורופורם (ch-FE) מספקים גם מידע חשוב המתייחס הפתוגן בתגובה מארח משטח waxes17,18, הבהרת בשלבים צמיחה מוקדמת של conidia פעם הנמסרים רגישים האיברים המארח (קרי פרחים, השחלות, פרי פיתוח). הפתוגן בתגובה לשינויים עונתיים שעוות משטח מארח ניתן גם לנטר שימוש בפרוטוקול זה. בהתאם לכך, bioassays מותאמים לעבודה עם או פה על בסיס מים או מבוססי כלורופורם FE כדי להמתיק את ההבדלים הטבועים בין שני החומרים האלה.
הנתונים המופקים bioassays חשף כי על בסיס מים עקירות לעורר רמות גבוהות יותר של conidiation משנית יותר מבוסס כלורופורם עקירות איפה שהיתה היענות appressorial מוחלטת, ולכן שמערבות תרכובות מרובים נוכח פה. מעניין, שניהם מהתגובות צמיחה נצפו כאשר באמצעות מי גשמים הפועלות מחוץ פרחים אוכמניות, חמוציות, המציין תרכובות מופחתים מרובים יכולים להישטף מפני השטח של פרחים. לפיכך, ניטור לגירוי פרחוני יספקו תובנה ההסתברות להצלחה פתוגן בכל מערכת חקלאית.
המטרה הסופית של פרוטוקול זה נועד לספק מתודולוגיה למידע ביצירת הבסיס הביולוגי על פתוגנים צמח פטרייתי בתגובה סימנים כימיים פרחוני, וכן ייזום מתודולוגיות יכול להשתמש במידע פרחוני זה כדי לסייע תהליכי קבלת החלטות וניהול מחלה הספציפיות-לאתר.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioassays גילוי התגובה fioriniae ג תמציות פרחים (FEs) פותחו עבור פרי אוכמניות, חמוציות רוט pathosystems אך ניתן להתאים בקלות אחרים צינה. פרוטוקול שתוארו לעיל יש כבר ערך להשגת ערכות נתונים חשובים רבים כולל, אך לא מוגבל: FE אפקטים מרובים מבודד של פתוגנים רבים, זמן-קורס מידע המתייחס צמיחה פטרייתי שלבים בנוכחות פס שונים, השוואה של טכניקות החילוץ, בדיקה של כימיקלים בודדים על צמיחה fioriniae ג ובידול, הערכה של פרחים בודדים איברים תמציות, השפעת טמפרטורה על fioriniae ג ואילו בנוכחות FE, אפקטים פנולוגיה שעווה התלויים עקירות, ואפקטים מי גשמים פרחוני. באמצעות שיטות אלה, נתונים שנוצרו יש גם בתנאי הבנה ברורה יותר של החיים fioriniae ג שלבים חלקית elucidates בגלל התקופה בלום היא כל כך קריטית השליטה של פירות רבים נרקב פתוגנים.
בתחילה, כל הפרחים עובדו באופן זהה פעיל-FE, אבל תהליך החילוץ עבר לכיוון באמצעות פרחים שלם. חיתוך פרחוני היה זמן רב, מעט מאוד השפעה על bioactivity של פס וכתוצאה מכך. עם זאת, איברים פרחים בודדים יכולים ויש כבר הערכה שימוש בפרוטוקול הזה, אבל זהירות רבה יש לנקוט כדי לא לגמרי macerate הרקמות פרחוני (1 סרט משלימה, עם הזהירות מפורט בשלב 2.3), כמו זה עלול לגרום שפורסמו פטריות-רעילים סטטיות תרכובות לתוך פה זה יכול לעוות את ההערכה מיקרוסקופיים. פחות עקירות פולשניים כגון מעבר –FE (משלימה את הסרט 2) ו- rw-FE הן כעת יותר חיובית עקב שלהם להקל על רכישת. בנוסף, טכניקות החילוץ אלה דורשים רק ואקום סינון כדי לרכוש פעילים ביולוגית סימנים כימיים פרחוני.
הפרחים מנוצל כל עקירות היו בדרך כלל בקירור של 0-3 ימים לפני הכנת תמצית. אתגר של פרוטוקול זה הוא ניהול זמן תחלופת FE (שדה אוסף דרך אחסון של תמציות). זה היה מתעצמת על דגימות רבות מספר מקורות ותאריכים. פרחים קפוא לא הוערכו במידה כלשהי אמיתי, כמו פרחים המופשרים מופיעים הורע, דהוי. עם זאת, ברגע הוכנו על פס על בסיס מים, חזר על הקפאת מפשיר הראה אין השפעה על bioactivity של פה, אז כל עוד פה והוקפאו הם במהירות לאחר הכנה bioassay (FE 3 בת קיימא).
כלורופורם מבוססי החילוץ מאפשר החקירה של פתוגן התגובות שעוות משטח תלת מימדי פרחוני/פרי במטוס מימדי באמצעות אידוי ch-FE על coverslips זכוכית דקה. עם זאת, סביר כי המבנים גבישי בפועל של שעוות שהופקדו מ ch-FE זהים השטח שממנו הם היו שנאספו. יש ליישם טכניקות משמעות, משלימה אם פטרייתי בתגובה שעווה ספציפי מבנים ויוו המוקד העיקרי של החקירה. תמציות מבוססי כלורופורם צריך תחזוקה אחסון יותר מאשר הקוד שיחולץ על בסיס מים. בנוסף לשמירת ch-FE תמציות בחושך, התרבות התא PTFE מרופדת צינור כובעים, מצלמות-מיקרוסקופים איטום גלישת צריך להיבדק באופן קבוע על הדלפות אויר והחליף במידת הצורך.
הרעיון של ניטור מי גשמים פרחוני נגר מושרשת ברעיון של קידום בכלי ניטור מחלות ספציפיות-לאתר. המכשירים איסוף מי גשמים ניתן להתאים ארכיטקטורות צמחים רבים אחרים, כל עוד המכשיר אוסף לוכדת מי גשמים יש להפעיל את הפרחים. גישה זו מספקת מידע על או לא גירוי פרחוני נוכח בשטח בכל זמן נתון, ניתן לנטר לאורך העונה. לחלופין, ניתן לפרוס אוסף התקנים במיקומים מרובים החופה כדי לקבוע עד כמה רמזים פרחוני נשטפו במהלך כל נתון הרטבה-אירוע. בעתיד ניסויים, rw-FE תכתיב כאשר יישומים פטריות כדאי להתחיל ולסיים מתי הם יכולים בבטחה. בנוסף, על ידי ניטור פנולוגיה שעווה התלויים עקירות (פרוטוקול סעיף 9), החשיבות של תקופת פריחה הפתוגן לביולוגיה הפך אפילו יותר ברור. מקטע זה נכללה גם להדגים את הגמישות של אלה bioassays, מתן שיטות המאפשרים השוואה side-by-side של שעוות משטח מארח המופרדות חנותם. הנתונים נוצר באמצעות טכניקות החילוץ פרחוני bioassays מייצגים מוחשי אינדיקטורים של גירוי הפתוגן, מחלקות כימי מסוים חשוב הפתוגן ביולוגיה, מטרות אסטרטגיות שליטה עתידית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים של ויליאם ס היינס, קרן מחקרים חמוציות ניחן האב ואת ניו ג’רזי אוכמניות וחמוציות מחקר המועצה, inc… על התמיכה. אנו מודים גם ג’ניפר Vaiciunas (והכוונה ההכנות פרחוני), כריסטין Constantelos (תרבות פטרייתי וההכנות פרחוני), דייוויד ג’ונס (תכשירים צמחיים, עקירות), לאנגלי Oudemans (תכשירים צמחיים, לצלם/צילום), ג’סי . לינץ ‘ (תכשירים צמחיים), רוקסן Tumnalis (תמיכה כללית), בו מתמחים סטודנט/קיץ.
Materials
| 0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter | VWR | 101102-280 | Blueberry floral extract (FE) clarification |
| 200-1000 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| 40-200 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| 5-40 µl pipette with tips | – | – | Equipment, any make within range will be adequate |
| Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter | Harbor Freight | 97098 | Blueberry rainwater (rw-)FE collection |
| Autoclave | Amsco | 3011 | Equipment, media preparation |
| Bar mesh matting (plastic mesh sheet) | Winco | BL-240 | Passive (pass)-FE collection |
| Benchtop timer | Fisher Scientific | 06-662-47 | Equipment, FE preparation |
| Black pressure/vacuum hose | VWR | 62994-795 | Vacuum filter component |
| Buchner funnel | Coors USA | 60240 | Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks |
| Bunsen burner | – | – | Equipment |
| Calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Media component |
| Centrifuge | Sorvall | RC 5B Plus | Equipment |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Fisher Scientific | 05-527-90 | Equipment |
| Centrifuge tubes (50 ml) | VWR | 10025-694 | Equipment, rw-FE collection |
| Cheesecloth (grade 50) | Fisher Scientific | AS240 | Equipment, FE preparation |
| Chloroform | VWR | JT9175-3 | Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free |
| Corn Meal Agar (CMA) | Fisher Scientific | B11132 | Pre-mix media, isolate storage on slants |
| Cotton-blue stain | Sigma-Aldrich | 61335 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Curved forceps (45˚) | Fisher Scientific | 10-270 | Equipment, flower processing and coverslip inversion |
| Difco Agar | VWR | 90004-032 | Media component |
| Drill-press | Delta | – | Equipment, rw-FE collection |
| EASYpure LF Ultrapure water | Barnstead | D738 | Equipment, deionized water source |
| Ethanol (95%) | – | – | Chemical |
| Filter flask (500 ml) | Pyrex | No. 5340 | Vacuum filter component |
| Freezer (set to -20˚ C) | – | – | Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE |
| Fume hood | Hamilton | – | Equipment, chloroform usage |
| Funnel (7 X 7 cm) | VWR | 60820-110 | Cranberry rw-FE collection, FE preparation |
| Generic glass slide | Fisher Scientific | 22-038-101 | Bioassay conductance |
| Generic plastic pump spray bottle | VWR | 16126-454 | pass-FE collection, at least 250 ml capacity |
| Glass cell culture tubes | – | – | Storage of ch-FE |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | Bioassay conductance |
| Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes) | – | – | Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID) |
| Glass-pipette (1-100 µl) | Hamilton Co. Inc. | #710 | ch-FE bioassay |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Hemocytometer | Bright-Line | 5971R10 | Equipment |
| Incubator (set to 25˚ C, dark) | Percival | 50036 | Equipment, bioassay conductance |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | W261106 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Laminar flow hood | Labconco | 3730400 | Equipment, sterile work environment |
| Metal probe (generic) | – | – | Equipment |
| Microcentrifuge tubes (2 ml) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Aqueous treatment mixture storage and preparation |
| Microscope, Leica DMLB | Leica | 020-519.010 | Equipment |
| Mortar (ceramic) | Coors USA | 60313 | Vacuum filter component |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | Flower collection |
| Paper disks (cut paper towels) | Office Basics | KCC01510 | humidity control in bioassay |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Plastic paraffin film |
| Pestle (ceramic) | Coors USA | 60314 | Vacuum filter component |
| Phenol crystals | Fisher Scientific | A92-100 | Lactophenol cotton-blue stain |
| Plastic bags (~100 mm X 152 mm) | Uline | S1294 | Equipment, flower refrigeration |
| Plastic cell culture dishes (9 cm diameter) | Fisher Scientific | FB0875712 | (Petri dish), bioassay conductance |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps | VWR | 60927-228 | Storage of ch-FE |
| Pyrex beakers (100 ml) | Pyrex | No. 1000 | Preparation of ch-FE |
| Pyrex bread-pan | – | – | pass-FE collection |
| Pyrex graduated cylinder | – | – | Equipment, FE preparation |
| Refrigerator (set to 4˚ C) | – | – | Equipment, storage of ch-FE |
| Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm) | – | – | Bioassay conductance |
| Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | 8940 | Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks |
| Stainless steel mesh strainer | VWR | 470149-756 | Preparation of ch-FE |
| Step drill bit (step-bit) | Dewalt | – | Equipment, rw-FE collection |
| Sterile loop (combi-loop) | Fisher Scientific | 22-363-602 | Culture preparation |
| Telephone wire (internal wires) | – | – | Blueberry rw-FE collection |
| Test tube basket | VWR | 470137-792 | Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket |
| V8 Juice | Campbell's Soup Company | – | Fungal media component |
| Vintage plastic mesh [strawberry] baskets | Donation | – | pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792) |
| Vortex Genie (Vortex) | Fisher Scientific | 12-812 | Spore suspension preparation |
| Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles | Whatman | 1001-055 | Vacuum filter component |
| White plastic twist ties (100 mm) | Uline | S-566W | Cranberry rw-FE collection |
References
- Pszczółkowska, A., Okorski, A. First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland. Plant Disease. 100, 2167 (2016).
- Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease. Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).
- Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).
- Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect. Mycologia. 100, 353-374 (2008).
- Pennycook, S. R. Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle. Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).
- Shivas, R. G., Tan, Y. P. A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov. Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).
- Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).
- Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development. Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).
- Milholland, R. D. . Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , (1995).
- DeMarsay, A. . Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , (2005).
- Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 86, 864-874 (1996).
- Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum. Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).
- Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields. Phytopathology. 92, 86 (2002).
- MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum. Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).
- Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves. Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).
- Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae. Phytopathology. 108, 561-567 (2017).
- Gager, J. . The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , (2015).
- Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).
- Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities. Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).
- Miller, P. M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology. 45, 461-462 (1955).
