Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse usando una maggiore fluorescenza verde Escherichia coliche esprimono proteine.
Abstract
Questo manoscritto descrive un metodo semplice e riproducibile per eseguire un test di fagocitosi. La prima parte di questo metodo prevede la costruzione di un vettore di animali-SUMO-EGFP (SUMO = piccolo ubiquitina-come modificatore) e che esprimono una maggiore proteina di fluorescenza verde (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Che esprimono EGFP e. coli è coincubated con i macrofagi per 1h a 37 ° C; il gruppo di controllo negativo viene incubato in ghiaccio per la stessa quantità di tempo. Quindi, i macrofagi sono pronti per la valutazione. I vantaggi di questa tecnica includono i passi semplici e diretti, e fagocitosi possono essere misurata con entrambi microscopio di fluorescenza e cytometer di flusso. Il che esprimono EGFP e. coli sono stabili e visualizzare un segnale di fluorescenza forte anche dopo i macrofagi sono fissati con paraformaldeide. Questo metodo non è solo adatto per la valutazione delle linee cellulari del macrofago o macrofagi primari in vitro ma adatto anche per la valutazione della fagocitosi di granulociti e monociti in cellule mononucleari del sangue periferico. I risultati mostrano che la capacità fagocitica dei macrofagi peritoneali dai giovani topi (otto-settimana-vecchio) è superiore a quella dei macrofagi dai topi invecchiati (16 mesi). In sintesi, questo metodo misura la fagocitosi del macrofago ed è adatto per studiare la funzione del sistema immunitario innato.
Introduction
Saggi di fagocitosi del macrofago sono spesso utilizzati per studiare la funzione immunitaria innata. La risposta immunitaria innata può indicare la suscettibilità all’infezione. Linee cellulari del macrofago sono ampiamente utilizzate negli studi di immunologia. Tuttavia, il passaggio prolungato può causare la perdita del gene e compromesse funzioni immuni in queste linee cellulari. Così, i macrofagi peritoneali primari sono l’oggetto ideale in cui studiare la funzione delle cellule1.
Anche se la risposta immunitaria innata è stata pensata per essere intatto nel corpo invecchiato, può fare diminuire la capacità fagocitica rispetto a che nel giovane corpo2,3. Qui, ci dimostrerà un metodo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali dai giovani (otto-settimana-vecchio) e anziani (16 mesi) mouse utilizzando che esprimono EGFP e. coli, che è conveniente, veloce ed economicamente fattibile.
L’uso di un ceppo che esprimono EGFP e. coli è uno dei vantaggi di questo test perché questi batteri sono stabili e visualizzare un segnale di fluorescenza forte, anche dopo i macrofagi sono stati risolti in paraformaldeide al 4% (p/v). Inoltre, utilizzando il che esprimono EGFP e. coli, i ricercatori non devono ulteriormente colorazione dopo fagocitosi, che consente di risparmiare tempo. Inoltre, i macrofagi sono immunoresponsive per e. coli , antigene di superficie, rendendo il e. coli più adatto per il test di fagocitosi di utilizzando i funghi che esprimono EGFP o branelli della fluorescina-etichettati.
Con che esprimono EGFP e. coli, un test di fagocitosi può essere facilmente compiuto in 2h e misurato da entrambi microscopia fluorescenza e citometria di flusso, a seconda della finalità del ricercatore. Poiché questo metodo misura direttamente la capacità fagocitica, i risultati sono più riproducibili rispetto ad altri metodi indiretti.
Questo metodo è stato convalidato anche in una linea cellulare RAW 264.7 e cellule mononucleari del sangue periferico umano4. Il testo riportato di seguito fornisce le istruzioni dettagliate per l’esecuzione di questo test e vengono evidenziati i passaggi critici che i ricercatori possono modificare per soddisfare le esigenze dei loro esperimenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura descritta in questo protocollo è abbastanza semplice e lineare. Una delle fasi critiche è di indurre l’espressione di EGFP su e. coli. Di solito, quando un gene da eucarioti, come EGFP, è progettato per esprimere nei procarioti come e. coli, c’è un rischio che la proteina si forma aggregati inattivi (corpi di inclusione), che cambia la struttura nativa e l’attività della proteina. Utilizzando il vettore animale-SUMO e costruendo il plasmide di animali-SUMO-EGFP, la proteina di fusione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fondazione di scienza naturale nazionale della Cina (No. 31800046) e la Fondazione con scienze naturali della provincia di Liaoning (No. 20170540262) sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato compiuto nei laboratori del centro di ricerca scientifica all’università secondo ospedale di Dalian medica. Gli autori vorrei ringraziare Xiao Lin Sang per la sua assistenza con la citometria a flusso e Bo Qu e Yang Dong-Chuan per la loro assistenza nella produzione video.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
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