Summary

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

人間の大食細胞のプロテオーム署名を取得し、これをマクロファージ偏波に低酸素環境の影響の定量に適用するためのプロトコルを提案します。

Abstract

大食細胞は自然免疫系細胞数感染病原体に応答から組織恒常性に至るまでの生理機能に関与します。これらの細胞の様々 な機能のアクティブ化の状態、また偏光と呼ばれる関連しています。これらの各種偏波の精密分子説明が大食細胞生物学の分野で優先されます。それは現在環境信号により偏光を制御する方法を説明する必要がある、多次元的なアプローチを認められています。本報告では、ヒトのマクロファージで各種偏波のプロテオームの署名を取得するためのプロトコルについて述べる.このプロトコルは、ゲル分別と Lys C/トリプシン消化細胞換散コンテンツから得られる大食細胞タンパク質発現のラベル無料数量に基づいています。またプロトコルに基づいてソリューションの消化との代替として使用する分画を中心に等電点を提供します。酸素濃度は、組織に関連する環境パラメーターは、このプロトコルを使用してどのように大気組成を探索するまたは低酸素環境マクロファージ偏波の分類に影響を与えます。

Introduction

大食細胞は自然免疫系細胞の数組織の恒常性は、細胞外マトリックス1の改造とアポトーシス細胞の除去を含む感染病原体に応答に至る生理機能に関与します。これらの細胞は、多くの可能なアクティベーション状態、偏波とも呼ばれますに変換する強力な表現型可塑性2によって特徴付けられます。これらの各種偏波の精密分子説明が大食細胞生物学3の分野で優先されます。それはいわゆる M1 ・ M2 の二分法、M1 プロ炎症性を表し M2 マクロファージ炎症を使用してこれらの分極を分類するために提案されている.このモデルは、急性感染症、アレルギー、肥満4など様々 な病理学的状況で適合します。しかし、慢性的な炎症を起こしている組織やがん、それ実証されていますこの分類は特定セルラ環境5,6,に存在するマクロファージ幅広い表現レパートリーを把握することができます。7します。 現在のコンセンサスは、多次元モデルを使用して、特定のアイソレータケージ信号8を統合するマクロファージの偏波がよりよく記述されています。この結論は、M1 ・ M2 モデルが得られた偏波9の記述で効率的であることを示す人間の大食細胞のトランスクリプトーム解析により確認されています。

研究は、ヒトのマクロファージで各種偏波のプロテオームの署名を取得するためのプロトコルを提供することを目的を発表しました。我々 は様々 な酸素濃度の環境下でヒトのマクロファージを区別し、ラベル無料定量化を実行する全体のマクロファージ プロテオームからペプチドを取得する方法について説明します。この数量は、様々 なタンパク質の発現レベルの比較をできます。幹細胞の研究は、環境キー パラメーター10として酸素の重要性を明らかにしたと私たちはこの組織パラメーターができるヒトのマクロファージ偏波にどのように影響を与えるかを理解ましょう。酸素の分圧は、20% がおよそ (正確な値は約 18.6% 水の存在をしながら細胞文化のインキュベーターでよく使用されるものに、人間の体で 3 (合計の大気圧) の 20% からの範囲に発見されています。考慮)。

前作は、肺胞間質性マクロファージ機能とは異なる、これらの違いが部分的に露出12が異なる酸素濃度のためおそらくビュー11の形態のポイントを示しています。さらに、骨髄由来マクロファージは、細菌12低酸素環境にさらされたときを phagocytize する能力の増大を示します。THP1 区別ヒトマクロファージ13、反対の効果が発見されているが、これらの結果は、大食細胞生物学のレギュレータを酸素には、人間の大食細胞の分子レベルでこの役割を明らかにする必要の考えを支持します。以前の研究では、これらの問題に対処するためのプロテオミクス手法を用いています。たくさんの蛋白質の発現量を同時に測定することにより我々 は偏波上の酸素の影響を強調表示され、新しい分子マーカーのリストを提供します。また、いくつかのマクロファージ機能にこれらの結果を関連することができた。特に、IL4 IL13 偏極マクロファージ、プロテオーム解析14によって明らかにされた ALOX15 のアップレギュレーションにリンクされていた」アポトーシス細胞の貪食能の率は増加したが分かった。本研究で我々 はこのような分析を実行する方法をについて説明します。

Protocol

ド識別、健康なドナーから血液サンプル (LRSC) は、承認されたプロトコル (CODECOH DC-2018-3114) の一部として EFS (フランス語国民の血サービス) から得られました。ドナーは、血液を使用するため署名された同意書を与えた。 1. メディアとバッファーの準備 [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x 非必須アミノ酸 (NEAA)] マクロファージ媒体を準備し、37 ° C に温める マクロ?…

Representative Results

差動遠心分離によって得られた末梢血単核球 (PBMCs) から始まって、プロトコルにより、CD14 の人口の取得+単球フローサイトメトリー (図 1) で 98% 以上の純度の評価。これらの単球は第二各種偏波 (図 2) に区別されます。ゲルの分別を選択、SDS ページのゲルの移行が目的のバンド数を取得する適応とバンドを切除 (<st…

Discussion

プロテオミクスは全細胞または細胞レベル下コンパートメントからの異なった蛋白質の表現を勉強する強力なツールで、セル換散のプロトコルの最適化とタンパク質の消化は、多くの研究によって対処されています。ゲルの消化力 (ポリアクリルアミド ゲルのマトリックス蛋白の消化)17、ソリューション18とフィルター支援サンプル準備19

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

午前リーグ国立 contre le がんとラ財団アーク注ぐラ凝ったシュル ルがんラで若いグループ リーダー プログラム (ATIP/アベニール Inserm CNRS)、によって資金を供給します。生物学のプラットフォーム (UTECHS MSBIO、パスツール研究所、パリ) の質量分析からマリエット Matondo に感謝いたします。我々 はローレン ・ アンダーソン原稿の彼女の読書をありがちましょう。

Materials

Hypoxia Working Station Oxford Optronix Hypoxylab
C6 Flow cytometer BD Accuri C6
Urea Agilent Technologies 5188-6435
Formic acid (FA) ARISTAR 450122M
R-250 Coomassie blue Biorad 1,610,436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) Calbiochem 437627
2D clean-up kit GE Healthcare 80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplement Gibco 61870044
HEPES 1 M Gibco 15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X Gibco 11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Gibco 14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column Harvard Apparatus 74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12% Life Technologies SAS NP0321 BOX
CD14 Microbeads human Miltenyi Biotec 130-050-201
MACS separation column LS Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Miltenyi Biotec 130-096-485
Interleukin 4 (IL4) Miltenyi Biotec 130-093-917
Interleukin 13 (IL13) Miltenyi Biotec 130-112-410
Interferon gamma (INFγ) Miltenyi Biotec 130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA) Pierce 28904
Trypsin/Lys-C Mix PROMEGA V5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail Roche 11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077) Sigma Aldrich 10771-100ML
Accumax Sigma Aldrich A7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB) Sigma Aldrich H4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% Sigma Aldrich A9576-50ML
Trisma-base Sigma Aldrich T1503
Glycerol Sigma Aldrich 49767
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Bromophenol blue Sigma Aldrich 114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% Sigma Aldrich 5030
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830
Acetonitrile Sigma Aldrich 34888
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Iodoacetamide Sigma Aldrich 57670
Thiourea Sigma Aldrich T8656
CHAPS Sigma Aldrich C9426
Micro BCA Assay Kit ThermoFisher 23235
5 mL sterile plastic pipette VWR 612-1685
Thermomixer C Eppendorf VWR 460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg Waters WAT036820

References

  1. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  2. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  3. Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
  4. Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
  5. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  6. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  7. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
  8. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  9. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  10. Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
  11. Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
  12. Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
  13. Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
  14. Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
  15. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  16. Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  18. Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
  19. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  20. Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
  21. Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
  22. Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
  23. Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
  24. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  25. Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
  26. Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).

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Cite This Article
Court, M., Malier, M., Millet, A. Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment. J. Vis. Exp. (143), e58727, doi:10.3791/58727 (2019).

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