Summary

Evaluación de la interacción entre el complemento proteína C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular

Published: June 15, 2019
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Summary

El componente de complemento C1q es una molécula proinflamatoria altamente expresada en el microambiente tisular que puede interactuar con la matriz extracelular. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico afecta la adhesión celular.

Abstract

Se ha demostrado cada vez más que el microambiente tumoral desempeña un papel activo en el crecimiento de la neoplasia y la metástasis. A través de diferentes vías, las células tumorales pueden reclutar eficientemente células estromales, inmunes y endoteliales mediante el secreto de factores estimulantes, quimioquinas y citoquinas. A su vez, estas células pueden alterar las propiedades de señalización del microambiente mediante la liberación de señales, metabolitos y componentes de matriz extracelular que promueven el crecimiento para mantener una alta proliferación y competencia metastásica. En este contexto, identificamos que el componente de complemento C1q, altamente expresado localmente por una serie de tumores malignos humanos, al interactuar con la matriz extracelular de ácido hialurónico, afecta fuertemente el comportamiento de las células primarias aisladas del tumor humano Especímenes. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico (HA) afecta la adhesión de las células tumorales, subyacente al hecho de que las propiedades biológicas de los componentes clave de la matriz extracelular (en este caso HA) pueden ser moldeadas por señales bioactivas hacia el tumor Progresión.

Introduction

El microambiente tumoral (TME) influye en el desarrollo y la progresión del cáncer, ya que puede proporcionar un nicho permisivo para la supervivencia celular, el crecimiento y la invasión. La identificación de nuevos actores clave en TME puede ser útil para el descubrimiento de nuevas herramientas moleculares para la terapia diana. TME incluye una red compleja y dinámica de células no malignas, como células endoteliales, fibroblastos y células del sistema inmunitario, incrustadas en los componentes de la matriz extracelular (ECM) circundantes, incluyendo colágenos, laminines, fibronectinas, proteoglicanos e hialuronanos. Tanto las células tumorales como las no tumorales sintetizan y secretan componentes de ECM junto con citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y enzimas de remodelación inflamatorias y matriciales que alteran en general las propiedades físicas, químicas y de señalización de TME. Entre estos componentes, el ácido hialurónico (HA) ha surgido para ejercer un papel crucial en la biología tumoral. A pesar de su simple composición química, HA, junto con sus moléculas de unión HA (hialadherinas), puede modular la angiogénesis, la capacidad de respuesta del sistema inmune y la remodelación de ECM de una manera dependiente del tamaño y la concentración1.

El sistema de complemento (C) también forma parte del TME local, que recientemente ha recibido una atención cada vez mayor. El sistema C abarca un conjunto de proteínas solubles y unidas a membranaimplicadas en la primera línea de defensa contra las no autocélulas, los elementos huésped no deseados y los patógenos. Funcionalmente, la C une los brazos de dos efectos de los sistemas innatos y adaptativos para promover la matanza directa de células o el montaje de una respuesta inflamatoria2. La activación c puede suprimir el crecimiento tumoral, destruyendo las células cancerosas o inhibiendo su crecimiento, pero se ha vuelto cada vez más claro que puede poseer una actividad que promueve el tumor al sostener la inflamación crónica, promoviendo el establecimiento de un ambiente inmunosupresor, induciendo angiogénesis y activando vías de señalización relacionadas con el cáncer3. En este contexto, C1q, la primera molécula de reconocimiento de la vía clásica del sistema C ha surgido para ejercer importantes funciones en el microambiente tumoral independientemente de la activación C4. C1q ha demostrado ser expresado localmente por una gama de tumores malignos humanos, donde puede favorecer laadhesión de las células cancerosas, la migración y la proliferación, además de la angiogénesis y la metástasis 5. Curiosamente C1q interactúa con un componente importante del ECM como HA.

Desarrollamos una técnica para aislar las células cancerosas primarias de la masa tumoral. Además, creamos la matriz, que puede estimular el microambiente tumoral, particularmente la interacción entre C1q y el ácido hialurónico de alto peso molecular. C1q unido a HA fue capaz de inducir la adhesión de las células tumorales.

Protocol

Las muestras de tejido de los pacientes fueron recogidas después del consentimiento informado tras la aprobación de las consideraciones éticas por el Consejo Institucional del Hospital Universitario de Trieste, Italia. 1. Aislamiento y cultivo de células tumorales (Día 1) Aísle las células del mesotelioma humano de las muestras sólidas de MPM. Picar finamente el tejido con un cortador para obtener fragmentos de aproximadamente 2-3 mm2 de tamaño e incubar en 5 ml d…

Representative Results

La HA es un polisacárido de alto peso molecular cargado negativamente, que se compone de unidades de disacárido de repetición (1-4)-D-glucurónico-(-,1-3)-N-acetil-D-glucosamina disacárido (Figura1B)7. La aparición de la unión de HA en la placa de 96 pocillos, así como la eficiencia de su inmovilización se probaron aprovechando el HA biotinilado (bio-HA). Las diferentes concentraciones de Bio-HA, que van desde 10 g/ml a 1 mg/ml…

Discussion

Describimos un método fácil para investigar cómo el componente de complemento C1q, interactuando con el ácido hialurónico, es capaz de modular el comportamiento de las células primarias aisladas de los tejidos tumorales humanos. Tanto HA como C1q están abundantemente presentes en el microambiente tisular tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, participando en varios procesos biológicos celulares. Por ejemplo, se ha demostrado que C1q está presente en el microambiente de la placenta, donde favorece …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Ivan Donati por proporcionar ha, Leonardo Amadio, Gabriella Zito (Departamento de Ginecología de IRCCS “Burlo Garofolo”, Trieste, Italia) y Andrea Romano (Unidad Clínica Operativa de Anatomía e Histología Patológica, Hospital Cattinara, Trieste, Italia ) para la recogida de muestras de tejido. Agradecemos también a Nicolá Morosini por la ayuda en la preparación del video y a Alex Coppola, la voz. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Salud Maternoinfantil, IRCCS “Burlo Garofolo”, Trieste, Italia (RC20/16) y Fondazione Cassa di Risparmio Trieste a R.Bulla.

Materials

100 µm pore filter BD Falcon 352360
Amphotericin B solution (fungizone) Sigma-Aldrich  1397-89-3
basic FGF Immunological Sciences GRF-15595
Calcium Chloride Sigma-Aldrich  C-4901
Collagenase type I Worthington Biochemical Corporation, DBA MX1D12644
D-Glucose Sigma-Aldrich  50-99-7
DNase I  Roche 10 104 159 001
EDTA Sigma-Aldrich  60-00-4
EGF Immunological Sciences GRF-10544
FAST DiI Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific D7756
Fetal bovine serum Gibco,  Thermo Fisher Scientific 10270-106
Fibronectin Roche 11051407001
Flask for cell culture Corning 430639 Sterile, vented
Gentamicin solution Sigma-Aldrich  G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)  Sigma-Aldrich  H6648 Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone
High molecular weight hyaluronic acid Kind gift by Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium  Gibco,  Thermo Fisher Scientific 11111-044 Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and  1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride Carlo Erba 13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt Sigma-Aldrich  M7653
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich  P0781
Time-lapse microscopy  Nikon  Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader Flow Labs
Trypsin Sigma-Aldrich  T4674

References

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Vidergar, R., Agostinis, C., Zacchi, P., Mangogna, A., Bossi, F., Zanconati, F., Confalonieri, M., Ricci, G., Bulla, R. Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (148), e58688, doi:10.3791/58688 (2019).

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