Summary

הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא

Published: June 15, 2019
doi:

Summary

המרכיב המשלים C1q היא מולקולה pro-דלקתיות מתבטאת במידה רבה בסביבה מיקרוסביבתית שיכולה לקיים אינטראקציה עם מטריצה החילוץ. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q הקשורים חומצה יאלורונית השפעות התא הדבקה.

Abstract

זה הוכח יותר ויותר כי מיקרוסביבה הגידול משחק תפקיד פעיל neoplasia צמיחה גרורות. באמצעות מסלולים שונים, תאים סרטניים יכול ביעילות לגייס סטרומה, תאים חיסוניים ואנדותל על ידי הפרשת גורמים מגירוי, נוגדנים ו ציטוקינים. בתורו, תאים אלה יכולים לשנות את מאפייני האיתות של הסביבה מיקרוידי שחרור הצמיחה-קידום אותות, מטבוליטים מטריקס רכיבים מטריצות כדי לקיים התפשטות גבוהה ויכולת גרורתית. בהקשר זה, אנו מזהים את המרכיב המשלים C1q, ביטוי מאוד באופן מקומי על ידי מגוון של גידולים ממאירים אנושיים, על האינטראקציה עם חומצה יאלורונית מטריצה המומנת, משפיע מאוד על ההתנהגות של תאים ראשוניים מבודדים מהגידול האנושי דגימות. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q כרוך חומצה יאלורונית (HA) משפיע על הדבקה תא הגידול, בבסיס העובדה המאפיינים הביולוגיים של רכיבי מפתח של מטריצה החילוץ (במקרה זה HA) יכול להיות מעוצב על ידי אותות אקטיביים לקראת הגידול תקדמות.

Introduction

מיקרוסביבה הגידול (TME) משפיע על התפתחות הסרטן והתקדמות מאז הוא יכול לספק נישה מתירני עבור הישרדות התא, צמיחה ופלישה. הזיהוי של נגני מפתח חדשים ב-TME עשוי להיות שימושי לגילוי כלים מולקולריים חדשים עבור טיפול היעד. TME כולל רשת מורכבת ודינמית של תאים שאינם ממאירים, כגון תאים אנדותל, פיברותקיעות ותאים של המערכת החיסונית, מוטבע בתוך מטריקס המקיפים (ECM) רכיבים כולל collagens, למינציה, fibronectins, . בסדר. הן הגידול והן תאים שאינם סרטניים לסנתז ולהפריש רכיבי ECM יחד עם ציטוקינים, נוגדנים, גורמי גדילה ושיפוץ מטריצה דלקתיות אנזימים הכולל לשנות את המאפיינים הפיזיים, כימיים, איתות של TME. בין המרכיבים האלה, חומצה יאלורונית (HA) התפתחה להפעיל תפקיד מכריע בביולוגיה הגידול. למרות ההרכב הכימי הפשוט שלה, HA, יחד עם המולקולות שלה הכריכה (היאלודונים), יכול לווסת אנגיוגנזה, תגובתיות המערכת החיסונית ו ECM שיפוץ בגודל וריכוז תלוי באופן1.

מערכת המשלים (C) היא גם חלק של TME המקומי, אשר קיבל לאחרונה את תשומת הלב הגוברת. מערכת C מקיפה סט של חלבונים מסיסים מאוגד קרום מעורב בשורה הראשונה של הגנה מפני תאים לא-עצמאיים, אלמנטים מארחים לא רצויים ופתוגנים. מבחינה פונקציונלית, C מקשרת את הזרועות שני-אפקטור של מערכות מולדת ואדפטיבית כדי לקדם או להרוג את התא הישיר או הרכבה של תגובה דלקתית2. C הפעלה יכול לדכא את צמיחת הגידול, על ידי השמדת תאים סרטניים או עיכוב outgrowth שלהם, אבל זה הפך יותר ויותר ברור כי זה יכול להחזיק הגידול קידום פעילות על ידי קיום דלקת כרונית, קידום הקמתה של מדכאים, הגורם לאנגיוגנזה, והפעלת מסלולים של אותות סרטניים הקשורים לסרטן3. בהקשר זה, C1q, את המולקולה הזיהוי הראשון של המסלול הקלאסי של מערכת C התפתחה להפעיל פונקציות חשובות מיקרוסביבה הגידול באופן עצמאי של הפעלת C4. C1q הוכח להיות מבוטא באופן מקומי על ידי מגוון של גידולים ממאירים האדם, שם הוא יכול לטובת הדבקה תא סרטן, הגירה והתפשטות בנוסף אנגיוגנזה גרורות5. מעניין C1q אינטראקציה עם המרכיבים העיקריים של ECM כגון HA.

פיתחנו טכניקה כדי לבודד את תאי הסרטן העיקריים ממסת הגידול. יתר על כן, יצרנו את המטריצה, אשר יכול לעורר מיקרוסביבה הגידול, במיוחד את האינטראקציה בין C1q ומשקל מולקולרי גבוה חומצה יאלורונית. C1q מאוגד HA היה מסוגל לגרום הדבקה של תאים סרטניים.

Protocol

דגימות רקמות מחולים נאספו לאחר הסכמה מושכלת בעקבות אישור השיקולים האתיים על ידי הוועד המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי של טריאסטה, איטליה. 1. בידוד תא גידול ותרבות (יום 1) בודד תאים מזותליומה האנושית מ MPM דגימות מוצקות. דק את הרקמה עם חותך להשיג שברים של כ 2-3 מ”מ2 בג?…

Representative Results

HA שלילית גבוה-מולקולרית משקל רב-שלילי, אשר מורכב של חוזר (β, 1-4)-D-חומצה גלוקורונית-(β, 1-3)-N-מרחריל-D-גלוקוסמיטין יחידות דיאכראמיד (איור 1B)7. המופע של הכריכה של HA על הצלחת 96-באר, כמו גם את היעילות של השתק שלה נבדקו לנצל את היתרונות של biotinylated HA (ביו-HA). ר…

Discussion

אנו מתארים שיטה קלה לחקור כיצד המשלים רכיב C1q, אינטראקציה עם חומצה יאלורונית, הוא מסוגל לווסת את ההתנהגות של תאים ראשוניים מבודדים מרקמות הגידול האנושי. שניהם HA ו C1q נמצאים בשפע בסביבה מיקרוברקמות הן בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים, המשתתפים בתהליכים ביולוגיים מספר תאים. למשל, C1q הוכח להיות ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים איוון Donati על מתן HA, לאונרדו Amadio, גבריאלה Zito (המחלקה של גינקולוגיה של IRCCS “Burlo Garofolo”, טריאסטה, איטליה) ו אנדריאה רומנו (יחידת המחקר הקליני של האנטומיה והיסטולוגיה הפתולוגיים, קאטניארה בית החולים, טריאסטה, איטליה ) עבור אוסף דגימת הרקמה. אנו מודים גם ניקולא מורוזיני לעזרה בהכנת וידאו ואלכס קופולה, הקול. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מהמכון לבריאות הילד, IRCCS “Burlo Garofolo”, טריאסטה, איטליה (RC20/16) ו Fondazione Cassa די ריספרמיו טריאסטה ל ר. בולה.

Materials

100 µm pore filter BD Falcon 352360
Amphotericin B solution (fungizone) Sigma-Aldrich  1397-89-3
basic FGF Immunological Sciences GRF-15595
Calcium Chloride Sigma-Aldrich  C-4901
Collagenase type I Worthington Biochemical Corporation, DBA MX1D12644
D-Glucose Sigma-Aldrich  50-99-7
DNase I  Roche 10 104 159 001
EDTA Sigma-Aldrich  60-00-4
EGF Immunological Sciences GRF-10544
FAST DiI Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific D7756
Fetal bovine serum Gibco,  Thermo Fisher Scientific 10270-106
Fibronectin Roche 11051407001
Flask for cell culture Corning 430639 Sterile, vented
Gentamicin solution Sigma-Aldrich  G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)  Sigma-Aldrich  H6648 Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone
High molecular weight hyaluronic acid Kind gift by Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium  Gibco,  Thermo Fisher Scientific 11111-044 Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and  1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride Carlo Erba 13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt Sigma-Aldrich  M7653
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich  P0781
Time-lapse microscopy  Nikon  Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader Flow Labs
Trypsin Sigma-Aldrich  T4674

References

  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

Play Video

Cite This Article
Vidergar, R., Agostinis, C., Zacchi, P., Mangogna, A., Bossi, F., Zanconati, F., Confalonieri, M., Ricci, G., Bulla, R. Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (148), e58688, doi:10.3791/58688 (2019).

View Video