用病毒载体接种后, mhc i 四分体染色同时定量抗载体和抗转基因特异性 cd8⁺ t 细胞

所述的所有方法都是根据《奥地利国家动物实验法》 (“tierversuchsgesetz”) 进行的, 奥地利国家当局批准了动物试验许可。 1. 缓冲器制备和样品收集 请注意:所使用的鼠标应变取决于所分析的表位。选择合适的四聚体, 结合在小鼠中表达的 mhc 类型, 例如, c57bl6 小鼠的 h-2kb。动物的性别和年龄将取决于科学问题。对于这里描述的大多数实验, 在实验开始时, 即第一次免疫时, 使用6-8周大的雌性老鼠. 制备 facs 缓冲液 (磷酸盐缓冲盐水 (pbs) + 1% 胎儿小牛血清 (fcs) + 0.1% 氮化钠 + 2 mm 乙二胺四乙酸 (edta) 和 facs 固定缓冲液 (1.5% (vw) 在 pbs 中)。请注意:建议提前准备好这两个缓冲区。在4°c 下存储, 直至使用。 血液: 如前所述, 从小鼠的尾静脉中收集20μl 的血液。请注意:血液也可以通过其他途径收集, 例如, 天麻或眼眶后窦.然而, 采血方法必须符合国家动物实验法和动物试验应用。从尾部静脉采集血液是需要反复少量血液的研究的理想选择。补偿控制和非染色控制需要额外的材料。 脾脏: 分离器官, 在注射器柱塞的帮助下, 通过70纳米和40μm 的细胞过滤器按压。执行红细胞裂解, 如步骤6中所述, 并计数。将 pbs 中的浓度调整为 1 x 107 cellsll。每个样品, 1 x 106 细胞是必需的。请注意:总是包括一些模拟免疫或控制载体免疫动物作为阴性对照。对于卵白蛋白 (ova)-四聚体, 从 ot-1 小鼠的样本可以作为阳性对照。不要忘记在计算中的未染色和补偿控制。如有必要, 实验中不同动物的样本可能会为此汇集在一起。 采集样品后, 直接进行染色。 2. 染色设置 为每个样品准备一个流式细胞仪管。适当地标记试管, 并将100μl 的器官悬浮液 (1 x10 6 细胞) 或20μl 的血液转移到每个管中。 脾脏: 在4-8°c 的 600 x 克离心 5分钟 , 并丢弃上清液。旋涡重新悬浮细胞颗粒。请注意:这将导致剩余体积在20μl 左右, 类似于血液样本的体积。 对于要使用的每个通道, 还准备一个流式细胞仪管进行补偿样品。准备一个额外的样品作为一个未染色的控制。 3. 四人运动染色 对于每个样品, 使用50μl 的四聚体稀释。有关建议的四聚体和优化稀释剂, 请参阅表1。请注意:使用四聚体或抗体时, 请关闭安全柜的光线, 保护样品不受光线的影响。 准备一个带有流式细胞仪缓冲液的管 (体积 = 50μlx 样品数量加上总体积的 10%, 以补偿移液错误)。 如表 1所示, 在最佳稀释时添加四聚体。漩涡的解决方案。请注意:当使用整个抗体面板 (cd3, cd8, cd43, cd44, cd62l) 与列出的荧光, 两个四聚体 (在 pe 和 apc) 可以包括在内。这两种四聚体可以在一次染色中组合 , 即与两个四聚体一起对细胞进行染色。 泰特拉默 多肽序列 基因 荧光 稀释 MHC I/OVA siinfekl h-2kb Apc 1:25 MHC I/VSV-NP rgyvyqgl h-2kb 体育 1:25 MHC I/EGFP hylstqsal h-2kd 体育 1:25 MHC I/LCMV-GP 卡维纳代 h-2db Apc 1:25 mhc i/hpv 16 e7 rahynivtf h-2db Apc 1:10 表 1: 建议的四聚体和最佳稀释.推荐的四聚体为一些免疫多肽的模型抗原 (Ovalbumin (ova) 和增强的绿色荧光蛋白 (egfp)) 或病原体成分 (室口炎病毒 (vsv) 核蛋白 (np), 淋巴细胞性脉络膜炎病毒 (lcmv) 糖蛋白 ( gp ) 和人状瘤病毒 ( hpv ) e7 oncoco 蛋白 ( e7 ) ) 。对于每一种, 肽序列和相应的等位基因, 以及推荐的荧光和优化稀释列出。 在每个样品和涡旋中加入50μl 的四聚体稀释剂。仅将流式细胞仪缓冲液 (不含四聚体) 添加到补偿控制和未染色样品中。 在37°c 下对样品进行20分钟的孵化, 防止光线照射。为了确保从四聚体到抗体染色的无缝过渡, 请在孵化期间按照第4步所述制备抗体混合物。请注意:对于每个单独的四聚体, 需要调整最佳条件 (稀释、孵育时间和温度)。 4. 抗体的制备 对于每个样本, 准备50μl 抗体混合物。 准备一个带有流式细胞仪缓冲液的管 (体积 = 50μlx 样品数量加上总体积的 10%, 以补偿移液误差)。 在稀释中添加抗体, 如表 2所示。请注意:根据科学问题的不同, 除了此处描述的标记组合之外, 还可以使用其他标记组合。确保在面板中始终包含抗 cd3 和 cd8 的抗体。 漩涡的解决方案。 抗体 荧光 稀释 μg/样品 标记 cd3 pe-cy7 1: 200 0.05 ctl (cd3+cd8+) cd8 太平洋蓝 1:750 0.013 v450 1: 100 0。1 cd43 fitc 1: 100 0.25 激活 (cd43+) cd44 pe-cy5 1: 250 0.04 天真 (cd44-cd62l+) 和效应器 (cd44+cd62l-) cd62l apc-cy7 1: 500 0.02 表 2: 本协议中使用的抗体和最佳稀释。第一列列出了推荐的表面标记 (cd3、cd8、cd43、cd44 和 cd62l)。对于每一个, 推荐的荧光体, 优化稀释和抗体样品的数量列出。在最后一列中, 指定了与每个标记标识的单元格类型。 准备用于补偿控制的抗体。对于每个补偿控制, 使用相应颜色的 cd8 抗体。 对于每个通道, 准备一个含有200μl 的流式细胞仪缓冲液的管, 并以相应的颜色添加1:200 稀释抗体的1:200。 圆的管。 立即进行染色。 5. 样品的染色 在4–8°c 的600xg 下, 在 600 x g 的情况下, 加入约 1 毫升的流式细胞仪缓冲液和离心机, 清洗样品一次。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。请注意:处理血液时, 请注意排出剩余液体时。在红细胞裂解之前, 血液不会粘附在流式细胞仪管的底部。或者, 吸气上清液。 在每个细胞颗粒和涡旋中轻轻加入50μl 抗体混合物。 在相应补偿控制的细胞颗粒中加入50μl 的每个补偿混合物, 并轻轻旋涡。 在未染色控制和涡旋的细胞颗粒中加入50μl 的流式细胞化缓冲液。 在4°c 下将所有样品加氢 30分钟, 防止光线照射。 使用器官时: 跳过步骤6。在4–8°c 下, 在 600 x 克的情况下, 加入约1–2毫升的流式细胞仪缓冲液和离心机, 清洗5分钟。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。 当处理血液时: 进入步骤 6 (红细胞裂解)。 6. 红细胞裂解 在每个样品中加入 500μl ack (氯化铵-钾) 缓冲液 25 , 然后轻轻涡旋。请注意:ack 缓冲液会导致渗透肿胀和裂解, 特别是红细胞。 在室温下在黑暗中孵化5分钟。 在4–8°c 的 600 x 克环境下加入1毫升的流式细胞仪缓冲液和离心机5分钟。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。注意: 当颗粒是相当红色, 重复红细胞的裂解。 在4–8°c 下, 在 600 x 克的情况下, 加入 ~ 1–ml 流式细胞仪缓冲液和离心机, 清洗5分钟。离心后, 丢弃上清液, 将剩余的液体排出成一叠纸巾。 7. 流式细胞仪测量和分析 在每个管中加入150–300μl 的流式细胞仪固定缓冲液, 并通过涡流混合。对于20μl 的血液, 150μl 的缓冲液就足够了。请注意:固定前, 一定要确保细胞重新悬浮, 以防止团块的形成。尽快进行流式细胞仪测量。 测量补偿控制并纠正任何光谱重叠。 设置顺序门, 如图 1所示, 用于选择 cd3+/cd8+单元格。 在淋巴细胞上的门使用向前和侧向散射 (面积) (非对数刻度)。 在淋巴细胞群中, 使用正向散射宽度与面积 (非对数尺度) 的单个细胞的门。 使用 cd3 和 cd8 通道绘制单细胞淋巴细胞 (对数尺度)。通过在 cd3+/cd8 + 细胞上浇注来识别 cd8+ t细胞。 在 cd8+ tetramer+细胞上绘制 cd8 + 与 tetramer+细胞和门, 如图 2所示。 如果可能, 为每个样本记录 cd3+/cd8+ 门中的 20, 000个细胞 (至少 5, 000个来自血液的细胞), 并保存为 fcs 文件。请注意:可能需要根据感兴趣的抗原特异性细胞的频率来调整要记录的细胞数量。 使用适当的分析软件分析 fcs 文件。如上文 (7.3 节) 所述, 使用门控策略并量化 cd8+四特拉特 + 细胞。