تعريب كوروليس موقعا في الدماغ الماوس
Summary
كوروليس موقعا من مجموعة صغيرة من الخلايا العصبية المعنية في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الماوس الدماغ أقسام لدراسات للبروتينات والمعادن في هذه النواة.
Abstract
كوروليس موضع (LC) هو محور رئيسي لإفراز إنتاج الخلايا العصبية التي تعدل عددا من الوظائف الفسيولوجية. تشوهات هيكلية أو وظيفية من LC تؤثر على عدة مناطق المخ بما في ذلك اللحاء، والحصين، والمخيخ، وقد تسهم في الاكتئاب والاضطراب الثنائي القطب، والقلق، وكذلك مرض باركنسون ومرض الزهايمر. غالباً ما تكون هذه الاضطرابات المرتبطة بانتهاك معدنية، بل يفهم دور المعادن في LC جزئيا فقط. الدراسات الفنية والسمات من LC ضرورية لفهم أفضل للأمراض البشرية ومساهمة من المعادن. الفئران نموذج تجريبي مستخدمة على نطاق واسع، ولكن الماوس LC الصغيرة (~0.3 مم) ومن الصعب تحديد لغير خبراء. هنا، يمكننا وصف بروتوكول المستندة إلى إيمونوهيستوتشيميستري خطوة بخطوة لتعريب LC في الدماغ الماوس. وتستخدم الدوبامين-β-hydroxylase (هذا)، وبدلاً من ذلك، تيروزين hydroxylase (TH)، كلا الإنزيمات عالية المعرب عنها في قانون العمل، كعلامات المناعي في شرائح المخ. يمكن استخدام الأقسام المتاخمة للمقاطع التي تحتوي على LC لمزيد من التحليل، بما في ذلك علم الأنسجة للدراسات المورفولوجية واختبار التمثيل الغذائي، فضلا عن تصوير المعادن بالأشعة السينية fluorescence مجهرية (إكسفم).
Introduction
كويروليوس موضع (LC) منطقة هامة في الدماغ وموقع رئيسي ل إنتاج إفراز (شمال شرق)1. قانون العمل يرسل الإسقاطات في جميع أنحاء الدماغ2 للقشرة وفي قرن آمون و المخيخ3 وينظم العمليات الفسيولوجية الرئيسية، بما في ذلك إيقاع سيركاديان4،5، الانتباه والذاكرة6، نشدد على7،8من العمليات الإدراكية والعاطفة9،10. اختلال وظيفي LC متورط في الاضطرابات العصبية والنفسية العصبية11، بما في ذلك باركنسون مرض12،،من1314، مرض الزهايمر14، الاكتئاب15 ،،من1617والهوس الاكتئابي18،19، والقلق20،21،،من2223، 24-ونظرا لهذه الأدوار، تحليل LC أمر حاسم لدراسة وظيفتها والخلل الوظيفي.
الفئران تستخدم على نطاق واسع لدراسات العمليات الفسيولوجية وباثوفيسيولوجيك. نظراً لصغر حجمها، قد الماوس LC متوسط قطرها ~ 300 ميكرومتر، مما يؤدي إلى صعوبة في تحديد موقع الهيكل. خلال تقطيع المخ، يمكن بسهولة تضيع قانون العمل في أقسام الاكليلية أو السهمي. الدراسات المتاحة التي تصف تحديد LC في الحيوانات لا توفر بروتوكول خطوة بخطوة أن اتباع غير خبير1،25. وهكذا يصف لنا لتقديم الإرشاد لتوطين LC، بروتوكول التي طورناها لتحديد موقع هذه المنطقة في الدماغ الماوس للعديد من التطبيقات (الشكل 1، الشكل 2، الشكل 3). ويسري البروتوكول بكشف الدماغ التي تسيطر عليها بعناية تمزيقها والمناعي هذا26،27، أو بدلاً من ذلك ال24، كلا الإنزيمات عالي التخصيب في ش28. حالما يقع LC إيمونوهيستوتشيميستري، يمكن استخدام شرائح المخ المجاورة لإجراء مزيد من الدراسات، بما في ذلك التحليلات المورفولوجية والايض، فضلا عن دراسات التصوير المعادن عن طريق الأشعة الفلورية مجهرية (إكسفم)29. يصف لنا إكسفم كمثال في هذا البروتوكول (الشكل 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
توجيه بشكل صحيح العينة خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. لأن نقوم باستخدام الميزات التشريحية السطحية الظهرية للدماغ لتحديد موقع LC (الحدود بين المخيخ وأدنى والاكيميه)، من المهم أن تكون محاذاة المقاطع بشكل صحيح. وهذا يتطلب الرعاية في وضع الدماغ بشكل صحيح في مصفوفة تقطيع المخ الماوس. ونحن نوصي ق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر أبيغيل موتشينديتسي للحفاظ على مستعمرة الماوس. استخدام مصدر فوتون متقدمة في “مختبر أرغون الوطني” تدعمها وزارة الطاقة الأمريكية، مكتب العلوم، “مكتب للطاقة العلوم الأساسية”، تحت رقم العقد: دي-AC02-06CH11357. ونحن نشكر أولغا أنتيبوفا والدكتور ستيفان فوغت لدعم المستخدم والمساعدة في “المصدر فوتون متقدمة”. تم تمويل هذا العمل من 2R01GM101502 منح “المعهد الوطني للصحة” إلى SL.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
References
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
- Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
- Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
- Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
- Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
- Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
- Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
- File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
- Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
- Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson’s disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
- Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson’s disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
- Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
- Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
- Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
- Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
- Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
- Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
- Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. 신경과학. 373, 7-19 (2018).
- Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
- McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
- Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
- Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
- Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
- Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
- Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
- Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
- Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
- Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
- Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
- Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson’s disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
- Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson’s disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, 565-574 (2016).
- James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).
