JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect

Published: March 19, 2019
doi:
10.3791/58594
, , , , , , , ,
1European Synchrotron Radiation Facility,Structural Biology Group, 2European Molecular Biology Laboratory, 3Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS (Institut de Biologie Structurale)

Summary

Presenteren we het gebruik van het MeshAndCollect-protocol bij het verkrijgen van een gegevensset voltooid diffractie, voor gebruik in latere structuurbepaling, samengesteld uit gedeeltelijke diffractie datasets verzameld uit vele kleine kristallen van de fluorescente proteïne Cerulean.

Abstract

Röntgendiffractie is de belangrijkste techniek gebruikt voor het verkrijgen van hoge resolutie informatie met betrekking tot de 3-dimensionale structuren van biologische macromoleculen. Tot voor kort, is een belangrijke voorwaarde de beschikbaarheid van relatief grote, goed buigingsinrichting kristallen, die vaak uitdagend om te verkrijgen. Echter, de komst van seriële kristallografie en een renaissance in multi kristal gegevens, vergaringsmethoden heeft ertoe geleid dat de beschikbaarheid van grote kristallen hoeft niet langer een beperkende factor te zijn. Hier, illustreren we het gebruik van de geautomatiseerde MeshAndCollect protocol, die eerst identificeert de standpunten van vele kleine kristallen gemonteerd op de dezelfde monsterhouder en vervolgens stuurt de collectie bij vanuit de kristallen met een reeks van gedeeltelijke diffractie gegevenssets voor latere samenvoegen en gebruik in structuurbepaling. MeshAndCollect kan worden toegepast op elk type van micro-kristallen, zelfs als zwak buigingsinrichting. Als voorbeeld presenteren wij hier het gebruik van de techniek op te lossen de kristalstructuur van de Cerulean cyaan fluorescente proteïne (GVB).

Introduction

Macromoleculaire röntgendiffractie (MX) is veruit de meest gebruikte methode voor het verkrijgen van atomaire resolutie inzicht in de driedimensionale structuren van biologische macromoleculen. Een grote knelpunten is echter de eis voor relatief grote, goed buigingsinrichting kristallen.

Vaak, en met name wanneer het kristalliseren van membraaneiwitten, slechts zeer kleine kristallen van een paar microns in de grootste afmeting kunnen worden verkregen. Stralingsschade effecten termijn de resolutie van een volledige diffractie-gegevens die kan worden verzameld van een enkele micro crystal2, en heel vaak, is het noodzakelijk om de signaal / ruisverhouding en vandaar het gegevensbestand resolutie, door het samenvoegen van verschillende gedeeltelijke diffractie datasets van verschillende, maar isomorf kristallen. De stijgingen van de fluxdichtheid van X-ray balken op synchrotron bronnen en elders (bijvoorbeeld X-ray gratis-elektron lasers (X-FELs)), hebben ertoe geleid dat nuttig gedeeltelijke diffractie datasets kan worden verzameld van zelfs zeer kleine kristallen van biologische macromoleculen. Dit, beurtelings, heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe technieken voor het verzamelen en samenvoegen van gedeeltelijke diffractie datasets verzameld van vele verschillende kristallen om het produceren van een complete set van gegevens voor de oplossing van de structuur. Dergelijke technieken worden vaak aangeduid als seriële kristallografie (SX)3,4,5,6,7,8. Een prototypische voorbeeld van SX is het gebruik van de injector apparaten te introduceren een smalle stroom van een crystal drijfmest in de X-ray bundel3,4,5. Een patroon van diffractie is telkens een kristal wordt blootgesteld aan x-stralen leidt tot de collectie, van vele duizenden afzonderlijke kristallen, van ‘nog’ diffractie beelden, gegevens die vervolgens wordt samengevoegd tot een complete set van gegevens opgenomen. Een groot nadeel van dit soort seriële data collectie is echter dat de verwerking van stilstaande beelden problematisch kan zijn. De kwaliteit van de gegevens is aanzienlijk verbeterd als kristallen kunnen worden gedraaid en/of meerdere diffractie afbeeldingen worden bijeengezocht uit het dezelfde kristal tijdens seriële kristallografie experimenten6.

MeshAndCollect1 werd ontwikkeld met het doel van het combineren van SX met ‘standaard’ verzamelen van de gegevens van de rotatie van de MX en maakt het mogelijk, in een automatische mode, onderzoekers voor het verzamelen van gedeeltelijke diffractie datasets van talrijke kristallen van hetzelfde macromoleculaire doel op de zelfde of verschillend voorbeeld houders gemonteerd. Een volledige diffractie-gegevensset wordt dan verkregen door het samenvoegen de meest isomorfe van de gedeeltelijk gegevensgroepen verzameld. MeshAndCollect is compatibel met alle beamline van de X-ray state-of-the-art synchrotron voor MX (idealiter een invoeging apparaat faciliteit met een relatief klein (20 µm of minder) beam grootte op de monster-positie). Naast de opstelling van volledige datasets uit een serie van kleine, goed diffracting kristallen is de methode ook zeer geschikt voor de eerste experimentele evaluatie van de kwaliteit van de diffractie van micro-kristallen en voor de verwerking van ondoorzichtige monsters, bijvoorbeeld in meso microcrystals membraan eiwitten9gegroeid.

Aan het begin van een MeshAndCollect experiment, worden de standpunten, in twee dimensies, van elk van de vele kristallen die zijn opgenomen in een enkele monsterhouder bepaald met behulp van een lage dosis X-ray scan. De beelden van de diffractie verzameld tijdens deze controle worden automatisch geanalyseerd door het programma DOZOR1, die Hiermee sorteert u de posities van de kristallen op de monsterhouder volgens hun respectieve diffractie-kracht. Posities voor het verzamelen van gedeeltelijk gegevensgroepen zijn toegewezen automatisch op basis van een licht-donkerscheiding van diffractie sterkte en, in de laatste stap, kleine wiggen diffractie vangegevens, rotatie, meestal ±5 ° worden bijeengezocht uit elke gekozen positie. De ervaring heeft geleerd dat dit rotatie bereik een voldoende hoeveelheid reflecties per crystal voor gedeeltelijke gegevensset schalen doeleinden, terwijl tegelijkertijd de vermindering van de mogelijke crystal centreren kwesties en de kans bevat op blootstelling van meerdere kristallen in een bijzonder drukke support1. De individuele diffractie gegevens wiggen (gedeeltelijke datasets) worden vervolgens verwerkt ofwel handmatig of met behulp van geautomatiseerde gegevensverwerking pijpleidingen10,11,12,13. Voor downstream structuurbepaling is het toen noodzakelijk om te vinden van de beste combinatie van gedeeltelijke gegevenssets als samengevoegde14,15,16 waarna de resulterende complete set van gegevens kan worden behandeld op dezelfde wijze Als een die afkomstig zijn uit een enkele kristal experimenteren.

Als een voorbeeld van MeshAndCollect in de praktijk presenteren we hier de oplossing van de kristalstructuur van de Cerulean cyaan fluorescente proteïne (GVB), met behulp van een gegevensset van de diffractie opgebouwd uit de combinatie van gedeeltelijke verzamelingen van gegevens verzameld uit een groot aantal microcrystals gemonteerd op de dezelfde steun van de steekproef. Cerulean heeft ontworpen van de groen fluorescente proteïne (GFP) uit de kwal Aequorea victoria17, waarvan fluorescerende chromofore wordt autocatalytically gevormd uit de cyclisatie van drie opeenvolgende aminozuurresidu’s. Cerulean wordt GFP verkregen door respectievelijk de eerste en tweede residuen van de chromofore, een serine en een tyrosine, tryptofaan (Y66W) te threonine (S65T) muteert en de aanpassing van de chromofore omgeving met verdere mutaties (Y145A, N146I, H148D, M153T en V163A) tot een belangrijke, maar suboptimaal fluorescentie beschermingsniveau QY = 0.4918,19,20. De suboptimaal fluorescerende eigenschappen van Cerulean hebben voorgesteld te worden gekoppeld aan de complexe eiwitten dynamiek waarbij de onvolmaakte stabilisatie van één van de elf β-strengen van het eiwit21 en voor de accommodatie van twee verschillende chromofoor isomeren afhankelijk van de pH en bestraling voorwaarden22. Wij kozen om te werken met Cerulean als een model eiwit ter illustratie van het gebruik van het MeshAndCollect-protocol vanwege het relatief gemak van tuning kristal grootte afhankelijk van de kristallisatie. De structuur van Cerulean is zeer gelijkaardig aan dat van de bovenliggende eiwit GFP, zoals het bestaat uit een β-vat gevormd door elf β-strengen die rond een α-helix, die de chromofore draagt.

Protocol

1. weergave en zuivering van Cerulean Opmerking: Dit is gebaseerd op het protocol gepubliceerd door Lelimousin et al. 21 Express zijn-gelabeld Cerulean in Escherichia coli BL21 cellen gekweekt bij 37 ° C in 4 L van auto afleidbare middellange23 tot OD600= 1 en vervolgens na een nacht bebroeden bij 27 ° C. Oogst de bacteriecellen op 5000 x g en lyse de cellen via ultrasoonapparaat (40%, 5 min, 10 s puls, 10 s pauze) in 200 mL buffer bestaat uit 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl en 1 x proteaseinhibitors EDTA-vrij. Laad het supernatant op een kolom zijn-trap Ni-NTA en Cerulean Elueer met 100 mM imidazol in dezelfde buffer voorwaarden. Zwembad de heldere gele gekleurde breuken. Het eiwit is intrinsiek gekleurd, vandaar de Cerulean-bevattende breuken zijn gemakkelijk te onderscheiden. Het zuiveren van het eiwit (4 mL) op een kolom S75 in 20 mM Tris pH 8,0. Zwembad de heldere gele breuken en concentraat de eiwit-oplossing tot 15 mg/mL. 2. kristallisatie Gebruik van de daling van de hangende damp diffusie techniek24 bij 20 ° C in Linbro platen. De putjes vullen met 1 mL van een precipitant oplossing, bestaande uit 100 mM HEPES bij pH 6,75, 12% PEG8000 en 100 mM MgCl2. Meng 1 µL van eiwitten geconcentreerd tot 15 mg/mL met 1 µL van precipitant oplossing voor de hangende druppels. Kristallen moeten worden weergegeven in de 24 h. Oogst de kristallen verkregen en overdracht die kunnen 100 µL van een seeding buffer samengesteld van 0,1 M HEPES pH 6,75, PEG 22% 8000. De kristallen met een 0,1 mL weefsel grinder slijpen en Verdun in het zaaien van de buffer (verhouding 1:100). Verteren een aliquoot gedeelte van de eiwit-stockoplossing (15 mg/mL) met trypsine (0,5 mg/mL in de dezelfde buffer) voor 1 h (1:10 (v/v)). Meng de verteerd eiwit-oplossing met 10% van het zaad-bevattende buffer (v/v). Groeien van kristallen (10 * 10 * 20 µm3) in 0,1 M HEPES pH 7, 14% PEG 8000, 0.1 MgCl2 in 1-1,5 μL hangende druppels met behulp van de methode van de verspreiding van de damp. 3. Crystal montage Gebruik een geschikt lus, bijvoorbeeld een mesh lus 700 vierkante gaten van 25 µm elke gemonteerd op een rug standaardmonster houder25. Pipetteer kristallen uit het kristallisatie drop (stap 2.6) in 1 µL van cryoprotectant oplossing (de goed precipitant gemengd met glycerol (20% v/v definitieve)). Monteer de eiwit crystal drijfmest op een gaas-lus door het bewegen van de lus onder de kristallen en opheffing hen uit de daling. Idealiter moet de kristallen in de grootte 5 µm-30 µm in maximale afmeting met geen overlapping is tussen kristallen gemonteerd in de lus. Pit uit overtollige vloeistof door het aanraken van de berg snel met filtreerpapier. Sediment de kristallen zodat ze in het vlak van de lus omringd door zo weinig bulk vloeistof mogelijk zitten. Duik de berg in een unipuck vol met vloeibare stikstof. Bewaar de puck op 100 K in een geschikte opslagcontainer tot lichtbundel tijd beschikbaar is. 4. offline voorbereiding van het experiment synchrotron Opmerking: Vraag synchrotron lichtbundel zo vroeg mogelijk tijd en volg de on line richtlijnen voor beschikbare toegangstypen en over hoe een aanvraag voor een bepaalde synchrotron indienen. De richtsnoeren van het ESRF vindt u op http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Als een lid van een ESRF blok toewijzing groep (zak), een toepassing voor elk specifiek project niet vereist is. In dit geval moeten onderzoekers hun tas verantwoordelijk over de planning van de lichtbundel tijd benaderen. Nadat het voorstel wordt aangenomen en een uitnodiging voor het experiment is ontvangen, hebben alle deelnemers veiligheidstraining te voltooien. Vul de “A-poot” (via het portaal van de gebruiker ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) met de vereiste veiligheidsinformatie op de monsters. Neem contact op met de lokale contactpersoon om te bespreken van het experiment. Zodra uw A-poot is ingediend en gevalideerd zal het u geven de experiment nummer en het wachtwoord. Verbinden met uitgebreide ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) en kies MX. Meld u aan met het experiment nummer en het wachtwoord van de A-poot. Selecteer verzending | Nieuw lid toevoegen en vul de gevraagde informatie. Selecteer Toevoegen perceel en vul de relevante gegevens. Selecteer Toevoegen Container, kies een unipuck en vul de nodige gegevens verlangen, waaronder de standpunten van de houders van het monster in de puck. 5. laden van het monster op een Beamline In de experimentele hok, laden de puck in de steekproef wisselaar (SC) dewar en Let op zijn standpunt. De experimentele cabine interlock en voert de controle hok. Meld u aan bij de ISPyB (https://esrf.fr/). Selecteer Bereiden Experiment, vinden de verzending, volgende en geven de beamline en de positie van de puck in de SC. Inloggen de beamline besturingssoftware, hier MXCuBE227,28 met de experimentele nummer en wachtwoord verstrekt over de A-poot. Druk op Sync voor het synchroniseren van de software van de controle van de beamline met de ISPyB database. Gebruik de software van de controle van de beamline, te monteren van de monsterhouder op de goniometer. In MXCuBE2, een positie in het samplegebied van wisselaar vlak tikken en uitgezocht van Mount monster. Voordeel halend uit de MK3 mini kappa goniometer29 geïnstalleerd hooguit van de straallijnen ESRF MX, gebruikt MXCuBE2 de “visuele herschikking” workflow30 voor het uitlijnen van het vliegtuig van de monsterhouder met de rotatie-as van de goniometer. Selecteer de centrum -knop, klik 3 center op het midden van de rand van het uiteinde van de lus. De positie van de gecentreerd opslaan door Opslaante schakelen. Klik nogmaals op de centrale knop, klik 3 center het midden van het begin van de stam van de lus. De tweede positie ook opslaan door op Opslaante klikken. Selecteer een van de opgeslagen gecentreerd posities door erop te klikken. Toevoegen onder Geavanceerdde werkstroom visuele heroriëntatie naar de MxCuBE2 wachtrij voor de verzameling van de gegevens. De werkstroom starten door te klikken op verzamelen wachtrij. Nadat de werkstroom wordt uitgelijnd op het vlak van de monsterhouder met de rotatie-as van de goniometer, center de monsterhouder opnieuw, ditmaal ergens in het midden van de Maas. De monsterhouder oriënteren zodat het gezicht van de Maas loodrecht op de richting van de lichtbundel X-ray staat door het draaien van de omega-as met behulp van MXCuBE2. In MXCuBE2, selecteer de grootte van de bundel nodig zijn voor het scannen van de monsterhouder (alleen voor de straallijnen met variabele lichtbundel grootte). Klik op het diafragma drop down menu in de software van de controle van de beamline en selecteer een waarde, bijvoorbeeld 10 µm. Definieer een gaas voor de mesh-scan. Klik op het gereedschapspictogram van de mazen in de MXCuBE2. Het mesh gereedschap venster zal verschijnen. In de weergave van het voorbeeld van MXCuBE2, trekken de Maas door de linker muisknop te klikken en slepen met de muis over het gebied met kristallen op de monsterhouder. Om op te slaan de Maas Klik op de Plus -knop in het werkvenster mesh (gaas wordt groen). 6. voorbereiden en uitvoeren van de werkstroom MeshAndCollect Op het gebied van de resolutie van MXCuBE2, voert u de resolutie (dmin) op welke diffractie afbeeldingen moeten worden verzameld, bijvoorbeeld hier 1.8 Å. Selecteer MeshAndCollect in het tabblad Geavanceerd data collectie, toe te voegen aan de wachtrij en klik verzamelen de wachtrij. In het venster parameter die wordt weergegeven door de beamline afhankelijke standaardparameters te gebruiken. In het experiment beschreven hier parameters 0.037 s blootstellingstijd per scan netpunt, 100% transmissie zijn (in dit geval leidend tot 4 x 1011 ph/s), 1 ° trilling per scan netlijn standaardwaarden. Klik op de Continue. De mesh-scan wordt uitgevoerd en de beelden van de diffractie verzameld op elk rasterpunt zijn geanalyseerd en gerangschikt volgens diffractie sterkte met de software DOZOR1. Dit proces wordt uitgevoerd op de achtergrond. Na de analyse DOZOR een warmte-kaart wordt gegenereerd en de volgorde voor latere gedeeltelijke gegevensverzamelingen is toegewezen automatisch op basis van diffractie kracht (Zie Figuur 1).Opmerking: De resultaten van deze stap kunnen ook worden gecontroleerd in de ISPyB. Voor de inzameling van gedeeltelijke gegevenssets die een nieuw lusje met instellingen in de software van de controle van de beamline opduikt, Selecteer geschikte waarden voor rotatie bereik (dat wil zeggen, 0.1 °), aantal afbeeldingen (bijvoorbeeld 100), belichtingstijd, resolutie, transmissie, omgekeerde straal enz idealiter de dosis voor elke wig worden verzameld moet onder de Garman limiet (30 MGy). De geschatte blootstellingstijd per beeld is 0.037 s tot 0,1 s in de beschreven experimentele omstandigheden. Klik op Doorgaan om te starten van de gedeeltelijke gegevensverzamelingen. 7. de verwerking van de gegevens Opmerking: De gedeeltelijk gegevensgroepen zijn geïntegreerd met een geschikt programma (XDS10). Hiervoor zal op een Python-script dat erkent iedere individuele gegevensverzameling, integreert het en zorgt ervoor dat tussen de verschillende gedeeltelijk gegevensgroepen indexeren strookt worden gebruikt. Open de map met de afbeeldingen: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean. Maak een kopie van de veiligheid van het proces-submap die gevonden kan worden in de map waar de gedeeltelijk gegevensgroepen worden verzameld. Op de Linux terminal, gebruikt u de opdracht cp-r proces process_backup. Navigeer naar de map van het proces en start de verwerking script. Op de Linux terminal, typ het commando cd proces en druk op enter. Type procMultiCrystalData en druk op enter.Opmerking: Het script zal vragen om een ruimtegroep en cel parameters (deze informatie is optioneel), voer deze volgens de instructies. Na een laatste bevestiging van de gebruiker, wordt het script automatisch uitgevoerd. 8. samenvoeging van gegevenssets Opmerking: Nadat alle gedeeltelijk gegevensgroepen zijn geïntegreerd de beste combinatie van hen worden samengevoegd om de uiteindelijke gegevensset voor gebruik in structuurbepaling en verfijning. Verschillende doelstellingen van dit samenvoegende proces kunnen worden volledige volledigheid (sterk aanbevolen), hoge multipliciteit of de beste gegevens statistieken te verkrijgen (hoge , lage R-factoren, enz.). De laatste kan soms worden ten koste van de volledigheid en/of multipliciteit dus deze optie moet met zorg worden gekozen. Het samenvoegen van de gedeeltelijk gegevensgroepen met behulp van het programma ccCluster14. Het hiërarchische Cluster analyse (HCA) gebruikt om te bepalen van de mogelijke combinaties van isomorfe gedeeltelijk gegevensgroepen. Typ ccCluster in de Unix-terminal te openen van de grafische gebruikersinterface (GUI).Opmerking: In de ccCluster GUI een dendrogram wordt getekend. Dit geeft een suggestie over de vraag welke gedeeltelijk gegevensgroepen best mogelijk worden samengevoegd op basis van isomorfisme tussen hen. Klik op een knooppunt dat overeenkomt met een waarde van over 0.4 op de verticale as. Hogere waarden zal in het algemeen meer gedeeltelijke gegevens sets maar leiden tot erger samenvoegen statistieken als gedeeltelijk gegevensgroepen minder isomorfe zullen bevatten. Klik op SAMENVOEGGEGEVENS. De geselecteerde cluster zal worden verwerkt in de achtergrond en de geschatte fuserende statistieken zal verschijnen in een nieuw tabblad in de GUI. Deze stap kan worden herhaald voor verschillende combinaties van gegevenssets. Voor een goede combinatie van gedeeltelijke gegevenssets de volledigheid moet dicht bij 100%, de waarden hoog (10 of hoger in de laagste resolutie shell) en de R-meas31 waarden laag (ongeveer 5% in de lage resolutie-shell). Voor elke combinatie geselecteerd door de gegenereerde input script te gebruiken om samen te voegen de gedeeltelijk gegevensgroepen gekozen in een enkele mtz bestand (dat wil zeggen, zinloos32). Definitief schaalt en samenvoegen van de gegevens van de intensiteit in dit bestand met behulp van een schaal programma (dat wil zeggen, doelloos32) en, als met een bestand afkomstig uit een enkele crystal gegevensverzameling, de uitvoer gebruiken voor latere fasering en structuur oplossing33 .

Representative Results

MeshAndCollect, zoals dit is geïmplementeerd in MXCuBE2 (Zie figuur 1A), werd gebruikt voor het verzamelen van gedeeltelijke diffractie datasets van kleine kristallen van Cerulean gelegen op de dezelfde monsterhouder waarin visuele identificatie van kristallen moeilijk was. Om het scherm van de monsterhouder, gelijk wij een raster boven het midden van de meshloop (Zie figuur 1B) en op basis van de DOZOR score warmte kaart (Zie figuren 1 c, 1 D) 85 gedeeltelijke diffractie datasets werden automatisch verzameld. Deze individueel werden geïntegreerd dan samengevoegd (zie hierboven) voor de productie van een gegevensset met 99,8% volledigheid op dmin = 1.7Å (Zie tabel 1). Half-set correlatie (CC1/2),34 in de hoogste resolutie shell was 60% (= 4.7). Zoals verwacht, kon de kristalstructuur van Cerulean eenvoudig worden opgelost door moleculaire vervanging33 met behulp van de gegevensset gegenereerd. Na verfijning verkregen we een Rwerken van 22,8% en een Rgratis 25,4%. Superpositie met de vooraf bepaalde structuur (VOB post 2WSO21) toont een globale rmsd op Cα posities van 0.1 Å. Statistieken van de samengevoegde gegevensset Clustering van de drempel 0.35 Aantal gedeeltelijke datasets 25 Ruimtegroep P212121 Eenheidscel (a, b, c) 50.98, 62.76, 69.50 Resolutie bereik 46.58-1,70 (1.73-1.70) Rmerge (alle ik + en ik-) 0.133 (0.743) Rmeas (alle ik + & ik-) 0.142 (0.813) Rpim (alle ik + & ik-) 0,047 (0.318) Opmerkingen totaal/uniek 220693/25129 Mean((I)/SD(I)) 13,8 (4.7) Mn(I) half-set correlatie CC(1/2) 0.994 (0.602) Volledigheid 99,8 (99.5) Veelheid 8,8 (6.5) Definitieve Rcryst 22,8 Definitieve Rgratis 25,4 Tabel 1: Statistieken van de samengevoegde gegevensset die aangeeft van de hoge kwaliteit van de gegevens verzameld. Figuur 1: met behulp van MeshAndCollect te verzamelen van een aantal gedeeltelijk gegevensgroepen uit een serie van kleine kristallen die zijn opgenomen in de dezelfde monsterhouder. A) user-interface van MXCuBE2. De groene ovaal boven het veld over-as viewer geeft aan het gereedschap Raster. B) met het is een raster getekend op het beeld van de monsterhouder in het leven-afbeeldingsveld. C) warmte kaart van de DOZOR scores. D) voorbeeld, een afbeelding van diffractie. E) Dendrogram na clusteranalyse van de hiërarchische. Gegevenssets in het rood werden gebruikt voor het samenvoegen. F) algemene structuur van Cerulean. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het succes van een MX-experiment is meestal afhankelijk van het bestaan van relatief grote, goed buigingsinrichting kristallen. Voor projecten waar optimalisatie van kleine kristallen douches aan grotere kristallen mislukt, biedt MeshAndCollect een mogelijkheid om het verkrijgen van een volledige diffractie dataset voor structuur oplossing via de combinatie van de isomorfe gedeeltelijk gegevensgroepen verzamelde uit een serie van kleine kristallen. De methode is compatibel met de straallijnen synchrotron voor MX, liefst met een hoge foton-flux en een kleine bundel diameter, uitgerust met een ultramoderne diffractometer apparaat en een snel-uitlezing detector. Op dergelijke een eindstation duurt het deel van de collectie gegevens van een dergelijk experiment ongeveer 20 minuten, afhankelijk van het aantal gedeeltelijke gegevensverzamelingen moeten worden verzameld en het aantal crystal-bevattende monster houders te analyseren.

De belangrijkste voorwaarde voor het welslagen van een MeshAndCollect-experiment is het bestaan van voldoende (ten minste 50, 100 ideaal) van buigingsinrichting posities op de monsterhouder. Vanuit ervaring moet de minimale grootte van de kristallen te analyseren ongeveer 5 µm in de kleinste dimensie. De methode is compatibel met elke vorm van standaard cryo-koeling compatibele proeven houders met de beste resultaten worden bereikt met behulp van mesh mounts die stijve en rechte.

Op de ESRF, wordt MeshAndCollect geïmplementeerd op een gebruiksvriendelijke manier in een Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) workflow30 beschikbaar van de software van de controle van het beamline van MXCuBE2. Een groot voordeel van MeshAndCollect ten opzichte van andere methoden van SX is dat de verzamelde gegevens kunnen worden verwerkt door standaard programma’s en geautomatiseerde pijpleidingen gebruikt voor één crystal MX.

Zoals onze voorbeeld aantoont, MeshAndCollect is zeer eenvoudig toe te passen en leidt tot een reeks van de verzamelingen van de gegevens van het gedeeltelijke diffractie, meestal verzameld van kleine kristallen, die kunnen worden samengevoegd tot een complete set van gegevens voor gebruik in structuur oplossing. Bovendien, MeshAndCollect heeft het potentieel om het openstellen van de ruimte van de bemonstering van eiwit kristallografie want het biedt een manier om bruikbare gegevens verzamelen van kristallisatie proeven waar de laatste stap van optimalisatie, de productie van grote kristallen, is mislukt.

In het licht van de huidige ontwikkelingen in de richting helderder X-ray bronnen (bijvoorbeeld extreem briljant bron (EBS) project/ESRF35) is het te verwachten dat als gevolg van verhoogde stralingsschade, het type multi kristal gegevensverzameling vergemakkelijkt door MeshAndCollect wordt de standaardmethode voor het verzamelen van gegevens, in plaats van een uitzondering-zoals momenteel het geval – synchrotron gebaseerde MX straallijnen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken de ESRF voor het verstrekken van de lichtbundel tijd door haar eigen onderzoeksprogramma.

Materials

Beamline ESRF ID 23-1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Crystallization plates XDXm with sealant Hampton Research HR3-306
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3) Life Technologies Thermo Fisher Scientific C600003
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
HEPES Euromedex 10-110-C
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
MgCl2 Sigma-Aldrich 13452-1KG
MicroMeshes 700/25 MiTeGen SKU: M3-L18SP-25L
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
PEG8000 Sigma-Aldrich P5413-500G
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
Superdex 75 10/300 -GL GE healthcare 17-5174-01
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Trypsin Sigma-Aldrich T9201-1G
Unipuck Molecular Dimensions MD7-601
Name Company Catalog Number Comments
Programs
ISPyB ESRF Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186–3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 local development
aimless MRC Laboratory of Molecular Biology Evans, P.R., Murshudov, G.N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204–1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRF Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844–1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017). local development
DOZOR ESRF Bourenkov and Popov, unpublished local development
MeshAndCollect workflow ESRF Zander, U. et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328–2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015). local development
MXCuBE2 ESRF Gabadinho, J. et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700–707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24–226 (2014). local development
XDS Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125–132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. 생화학. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. 생화학. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. . Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269 (1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution?. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 – 2022). The orange book. , (2015).

Tags

MeshAndCollectSerial CrystallographyRotation Data CollectionSmall CrystalsPuck SamplesStructure SolutionLigand ScreeningSynchrotron BeamlineVMXProtein Crystallography BeamlineSample ChangerData CollectionVisual Reorientation Workflow

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hutin, S., Santoni, G., Zander, U., Foos, N., Aumonier, S., Gotthard, G., Royant, A., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G. Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect. J. Vis. Exp. (145), e58594, doi:10.3791/58594 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image