Come quantificare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge fuse spettralmente distinti geneticamente accoppiati e proteine fluorescenti. Queste chimere di proteina fluorescente permettono quantificazione della frazione PA-FP è fotoattivazione di essere fluorescente, cioè, l’efficienza di fotoattivazione. Il protocollo rivela che i diversi modi di fotoattivazione rendimento fotoattivazione diverse efficienze.
Abstract
Fuse e – proteine fluorescenti convertibile (PA-FPs) sono state utilizzate in microscopia a fluorescenza cellule vive per analizzare la dinamica di cellule e proteine Ensemble. Finora, nessun metodo è stato disponibile per quantificare in massa e in vivo le cellule espresso quanti del PA-FPs sono fotoattivazione di fluorescenza.
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge righelli interni, vale a dire, geneticamente accoppiato spettralmente distinta (fuse) proteine fluorescenti, a ratiometrically quantificare la frazione di tutte le PA-FPs espresse in una cellula che sono accesi per essere fluorescente. Usando questo protocollo, mostriamo che diverse modalità di fotoattivazione dato fotoattivazione diverse efficienze. Fotoattivazione breve ad alta potenza con un laser confocale a scansione microscopio (CLSM) ha provocato fino a quattro volte inferiore fotoattivazione efficienza di centinaia di esposizioni a basso livello applicate da CLSM o un breve impulso applicato da widefield illuminazione. Mentre il protocollo è stato esemplificato qui per GFP (PA-) e (PA-) Cherry, può in linea di principio essere applicato a qualsiasi coppia di proteina fluorescente fuse o fotoconvertibile spettralmente distinta e qualsiasi set-up sperimentale.
Introduction
Nel 2002, il primo ampiamente applicabili fuse (PA-GFP1) e fotoconvertibile (Kaede2) proteine fluorescenti sono stati descritti. Queste proteine fluorescenti ottico evidenziatore modificarne le proprietà spettrali all’irradiazione con luce UV, cioè, essi diventano luminose (proteine fluorescenti fuse, cioè, PA-FPs), o cambiare il loro colore (fotoconvertibile FPs). Fino ad oggi, diversi reversibile e irreversibile fuse e fotoconvertibile proteine fluorescenti sono stati sviluppati3,4. Negli studi ensemble o alla rinfusa, evidenziatori ottici sono stati usati per studiare la dinamica di celle intere o proteine e la connettività dei compartimenti subcellulari. Inoltre, evidenziatori ottico abilitati singola molecola basata superresolution tecniche quali PALM5 e FPALM6di imaging.
Anche se i processichimici foto durante la fotoattivazione o – conversione sono state descritte per molti ottici evidenziatori e strutture cristallografiche anche prima e dopo la fotoattivazione / – conversione sono state apportate disponibili7 , 8, il sottostante meccanismofisico foto di fotoattivazione e – conversione completamente non è capito. Inoltre, finora solo grezza esiste stima dell’efficienza di fotoattivazione e – conversione, vale a dire, la frazione di proteine fluorescenti espresso che è in realtà la photoconverted o la fotoattivazione di essere fluorescente. In vitro studi ensemble sono stati segnalati quantificare lo spostamento in spettri di assorbimento e la quantità di nativo e ha attivato la proteina in un gel9,10,11.
Qui, presentiamo un protocollo che coinvolge le chimere di proteina fluorescente per valutare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive. Ogni volta che lavora con proteine fluorescenti geneticamente codificate, la quantità assoluta di proteina espressa varia da cellula a cellula ed è sconosciuta. Se una cellula che esprime un PA-FP Mostra un segnale luminoso dopo fotoattivazione rispetto a un’altra cella, non può essere differenziato se questo segnale luminoso è dovuto più alta espressione di PA-FP o un più efficiente fotoattivazione di PA-FP. Per standardizzare il livello di espressione in cellule, introduciamo interni governanti di proteine fluorescenti spettralmente distinte geneticamente accoppiate. Accoppiando l’informazione genetica di una proteina fluorescente fuse per un spettralmente distinta sempre su proteine fluorescenti, governanti interne vengono creati che sarà ancora espresso per un importo totale sconosciuto ma in una quantità fissa e nota relativa di 1: 1 questa strategia permette la caratterizzazione quantitativa di diversi schemi di fotoattivazione UV-luce, cioè, la valutazione della quantità relativa di PA-FPs che può essere la fotoattivazione con diverse modalità di fotoattivazione e quindi permette per definire schemi di fotoattivazione che sono più efficaci di altre. Inoltre, questa strategia permette in linea di principio, la valutazione della quantificazione assoluta della frazione fotoattivazione PA-FP. A tal fine, è importante rendersi conto che gli studi presentati ensemble sono basati su intensità che rende l’analisi più complessa, come stabilito nel presente protocollo. Parametri che determinano l’intensità di fluorescenza misurata, cioè, diverse luminosità molecolare, assorbanza e spettri di emissione e FRET effetti, devono essere considerati quando si confrontano le intensità di fluorescenza di diverse proteine fluorescenti.
La quantificazione di basati su intensità di raziometrici presentato di fotoattivazione efficienza è esemplificata per PA-GFP e PA-ciliegia in cellule vive, ma in linea di principio ampiamente applicabile e può essere utilizzata per qualsiasi proteina fluorescente fuse sotto qualsiasi condizione sperimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Finora, nessun metodo ha esistito per determinare in massa la frazione di PA-FPs espressa in cellule vive che è fotoattivazione di essere fluorescente. Il protocollo presentato può essere utilizzato per qualsiasi coppia di proteina fluorescente spettralmente distinta. Mentre esemplificato qui per l’irreversibile PA PA-FPs-GFP e PA-Cherry, questo approccio è in linea di principio applicabile alle proteine fotoconvertibile pure. La proteina fluorescente spettralmente distinta, tuttavia, dovrà essere selezionata con att…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il laboratorio Dorigo e il servizio di Imaging di Neuroscienze presso la Stanford University School of Medicine per fornire attrezzature e lo spazio per questo progetto.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
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