셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

많은 생물학 과정 세포 세포 상호 작용, 예를 들어, 셀 접착^1,2,3, 셀 셀 퓨전⁴ 및 세포 인식⁵사이트에서 발생합니다. 이러한 이벤트는 특히 중요 한 다세포 생물의 세포-세포 커뮤니케이션, 예를 들어, 면역 반응 동안에 대 한 개발 중입니다. 이 프로세스는 일반적으로 즉, 이웃 세포의 원형질 막 (오후)에 표면에 지역화 되 고 규제에서 공간과 시간을 정확 하 게 세포 세포 접촉에서 특정 상호 작용을 받을 단백질에 의해 중재 됩니다. 대부분의 경우에서 이러한 상호 작용 직접 호모-또는 heterotypic 단백질-단백질 트랜스 상호 작용, 하지만 또한 이온 또는 extracellular 링커¹로 작동 하는 ligands를 포함 될 수 있습니다. 비록 기본적인 중요성의, 살아있는 세포의 기본 환경에서 직접 이러한 특정 단백질-단백질 상호 작용을 조사 하는 분석 실험의 부족이 이다. 많은 방법 중 필요 셀 중단 (예, 생 화 확 적인 분석 실험 공동 immunoprecipitation⁶등), 고정 (예를 들어, 일부 최고 해결책 광학 현미경 검사 법 기술과 세포-세포의 전자 현미경의 ⁷연락처), 또는 일반적인, 예를 들어, 집계 / 접착 분석 실험^8,9. 이 문제를 해결 하려면 형광 기법 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)¹⁰ 또는 형광 보완성¹¹기반으로 구현 되었습니다. 그러나, fluorophores 사이 충분히 작은 거리를 위해 이러한 메서드는 단백질¹⁰, 트랜스 상호 작용을 잠재적으로 방해의 extracellular 측에 형광 라벨 필요 합니다.

여기, 우리 셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 대체 형광 기반 분석 결과 제시. 이 방법은 결합 형광 크로스-상관 관계 접근 (검색 형광 교차 상관 분광학 (sFCCS), 교차 상관 번호와 밝기 (ccN & B))의 단백질의 융합 개념을 표현 하는 셀의 혼합 관심, 예를 들어, 접착 수용 체. 두 개의 상호 작용 세포에 조사 수용 체는 세포내에서 2 개의 괴기 하 게 분리 된 형광 성 단백질 (FPs), 표시 됩니다 ( 그림 1A참조) 사이드.

고용된 방법 confocal 레이저 스캐닝 현미경의 초점 볼륨을 통해 형광 성 융해 단백질의 방산 움직임에 의해 유도 된 형광 변동에 대 한 통계 분석을 기반으로 합니다. 더 자세히 분석 결과 프로브 셀 연락처에서 두 이웃 PMs에 관심사의 단백질의 공동 보급 합니다. 단백질 트랜스 상호 작용을 받을 경우이 트랜스 단지 두 스펙트럼 채널에 방출, 두에 미터의 상관된 형광 변화를 일으키는 형광 단백질을 수행 한다. 다른 한편으로, 아무 바인딩 경우 PMs를 직면 하 고 있는 단백질의 번호 변동 독립, 아무 상관된 변동 원인이 될 것입니다. 인수는 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 1) sFCCS-셀 접촉에서 선 모양의 검사에 근거 하 고 효과적으로 접촉 지역에 위치한 자리에 상호 작용을 조사. 형광 변화의 시간적 분석을 통해 sFCCS 또한 역학 정보를 제공 한다 즉, 단백질 복합물;의 확산 계수를 2) ccN & B 세포 세포 접촉 지역에서 취득 하는 이미지의 시퀀스에 대 한 pixel-wise 분석 기반으로 합니다. 프로브 하는 기능이 고 전체 따라 지도 상호 작용 영역 (하나의 초점 비행기), 문의 하지만 역학에 정보를 제공 하지 않습니다. 두 가지 방법, 즉, 평균 형광 신호 시간 단위에 단일 확산 단백질 복합물에 의해 방출 하 고, 따라서,에서 단백질 복합물의 산출할의 견적을 제공 분자 밝기의 분석 결합 될 수 있다 셀 연락처입니다.

이 문서에서 우리는 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 제시 분석 결과 수행 하기 위해 샘플 준비, 계측기 교정, 데이터 수집 및 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 모든 악기와 광자 계산 또는 아날로그 탐지기 높은 숫자 조리개와 목표에 실험을 수행할 수 있습니다. 우리 또한 프로토콜의 중요 한 단계를 토론 하 고 artefactual 신호 변동, 예를 들면, 감지기 소음, photobleaching 또는 셀 운동 발생 하는 여러 프로세스에 대 한 수정 계획을 제공 합니다. 원래 부착 세포 간의 상호 작용을 개발, 분석 결과 현 탁 액 셀을 수정할 수 있습니다 또는 적응 모델 멤브레인 시스템, 예를 들면, 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 또는 거 대 한 플라즈마 막 소포 (GPMVs), 수는 상호 작용 다른 지질 환경에서 또는 조직된 골격^12,13의 부재에서 부 량이 고

형광 교차 상관 분광학 검색 형광 교차 상관 분광학¹⁴ 의 수정된 된 버전 이며, 지질 막¹⁵의 느린 방산 역학 조사 하도록 특별히 설계 되었습니다. 그것은 관심의 형광 단백질을 포함 하는 오후에 수직 라인 스캔 수집을 기반으로 합니다. 2 개의 다르게 분류 단백질의 상호 작용을, 인수 spectrally 분리 fluorophores에 대 한 두 개의 레이저 라인 및 2 개의 검색 창을 사용 하 여의 스펙트럼 채널 두 개에서 수행 됩니다. 때문에 오후에 있는 단백질의 느린 유포 역학 (D≤ ~ 1 µ m²/s), 크로스 토크 무료 측정¹⁵라인을 라인에서 흥분 체계를 대체 하 여 수행할 수 있습니다. 로 시작 하는 분석: block-wise ~ 1000 라인, 2) 위치와 함께 최대 형광 신호즉, 오후, 각 블록에 위치 결정의 평균 3) 변화에 따라 측면 셀 운동 1) 정렬 알고리즘 수정 일반적인 기원^12,15, 각 채널에 별도로 모든 블록의 다음, 오후에 해당 하는 픽셀의 자동 선택 모든 정렬된 라인 (즉, 센터 ± 2.5σ)의 합계의 가우스 적합에서 중앙 영역을 선택 하 여 수행 됩니다. 각 줄에 신호의 통합 수익률 막 형광 시계열 f (t) 각 채널에 (g = 녹색 채널, r = 빨강 채널). 픽셀 크기가 작은 만큼, 예를 들어, 수는 < 200 nm, 포인트의 형태를 재구성 하 기능을 확산 하 고에 해당 하는 오후의 위치는 센터. 상당한 photobleaching 존재 각 채널에서 형광 시계열 수 두 배 지 수 함수 모델링 있으며 다음 다음 수식을 사용 하 여 수정:¹⁶

.    (1)

이 수식은 효과적으로 진폭 및 확산 시간 f (t)^c, f (t)교정된 얻어질 것 이다 매개 변수 추정에 비해의 상관 관계 분석에서 얻은 수정 주의에 중요 하다. 다음, 자동 및 교차 상관 기능 (ACFs / CCFs) 형광의 신호 계산 됩니다:

(2)

(3)

여기서 δF_나 F_i(t)-= F_i(t) 와 나 g, r=.

2 차원 확산 모델은 다음 모든 상관 관계 기능 (CFs)에 장착 되어:

.   (4)

여기, N 각 채널에 대 한 확산 시간 관찰 볼륨과 τ_d 에 형광 단백질의 수를 나타냅니다. 이 모델 고려는 설명된 실험 설정에서 x-z 평면에서 발생 하는 오후에 있는 단백질의 유포 형광 상관 관계의 일반적으로 사용 되는 구성 달리 분광학 (FCS) 실험 조사 하는 세포 막에 confocal 볼륨¹⁷의 x y 평면에서 보급. 허리 w₀ 와 구조 인자 S, 설명 하는 신장 z, S에에서 초점 볼륨의 w_z = w_z/w₀, 괴기 하 게 비슷한 염료와 같은 광학 설정 포인트 FCS 교정 측정에서 얻을 수 있습니다 이미 사용 가능한 값을 사용 하 여 확산 계수에 대 한 D_염료:

(5)

τ_{d, 염료는} 피팅 데이터를 3 차원 확산에 대 한 모델에서 얻은 염료 분자의 측정 된 평균 보급 시간에 분수 모든 N 분자의 T 의 계정 전환으로 복용 한 시간 상수와 triplet 상태 τ_τ:

.   (6)

마지막으로, 확산 계수 (D), 분자 명도 값 (ε) 및 sFCCS 데이터 (rel.cc.)의 상대 교차 상관은 다음과 같이 계산 됩니다.

(7)

(8)

(9)

어디 간 상관 함수의 진폭은 G_크로스(0)와 i-번째 채널의 자기 상관 함수의 진폭은 이다.

이 정의 상대 교차 상관, 즉 의 최대 수식 9에 의미 를 대신 사용 하 여 고려는 단지 두 개의 단백질 종의 다양 한 농도의 최대 수에 의해 제한 됩니다는 낮은 번호에 종입니다.

교차 상관 수와 밝기 기반 샘플에서 고정된 위치에서 시간이 지남에 인수는 이미지 스택의 각 픽셀에 대 한 형광 강도의 순간 분석 일반적으로 100 ~ 200의 구성 된 프레임, 2 개의 스펙트럼 채널 ( g = 그린 채널, r = 빨강 채널). 시간적 의미에서 나_나 및 분산 , 분자 밝기 ε_i 및 숫자 n_나 각 픽셀에 스펙트럼 채널 계산 됩니다 (나 = g, r)¹⁸:

(10)

. (11)

그것은 진정한 광자 계수 검출기의 이상적인 경우에는 주어진된 방정식 적용 해야 합니다. 아날로그 탐지 시스템에 대 한 다음 방정식^19,20적용:

(12)

.   (13)

여기, S는 감지 된 광자와 기록된 디지털 카운트 사이의 변환 계수 판독 소음 및 오프셋 검출기 강도 오프셋을 나타냅니다. 일반적으로, 이러한 수량 해야 될 보정, 꾸준한 조명¹⁹, 예를 들어, 반사 금속 표면 또는 말린된 염료 솔루션에 대 한 강도의 기능으로 측정 하는 검출기 편차에 따라 모든 검출기 종류에 대 한. 오프셋 은 여기 빛 없이 샘플 카운트 속도 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 검출기 관련 분산의 선형 회귀를 수행 하 여 (나) 강도 플롯, S 대와 결정된¹⁹일 수 있다:

.   (14)

마지막으로, 교차 상관 밝기 각 픽셀에 계산 되 고²¹ 으로 일반적 정의

(15)

어디 크로스-분산은 .

수명이 긴 동요를 필터링 하기 위해 모든 ccN & B 계산 수행 됩니다 다음 필터링 하지, 독립적으로 각 픽셀²²기차. 간단히, n_i, ε_난 (나 = g, r)와 B_cc 슬라이딩의 예를 들어, 세그먼트 8-15 프레임에서 계산 됩니다. 이렇게 얻어진 값은 다음 값을 가져올 최종 픽셀 수와 밝기 평균 수 있습니다.

산출할 분석
셀 연락처에서 단백질 복합물의 산출할을 추정 하기 위해서는 분자 밝기는 sFCCS 또는 ccN & B 데이터에 대 한 각 스펙트럼 채널에 별도로 분석할 수 있습니다. SFCCS에서 한 명도 값 측정 각 채널에서 당 얻은 것입니다. CcN & B, 셀 연락처에 해당 하는 모든 픽셀의 밝기 히스토그램 취득 하 고 평균 (또는 평균) 값 측정을 위한 대표적인 밝기로 사용할 수 있습니다. 단위체 참조에 동일한 분석을 수행 하 여 모든 명도 값 감지 단백질 복합물의 평균 oligomeric 상태를 직접 정규화 될 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 oligomeric 상태의 과소에 발생할 수 있는 비 형광 FPs의 존재에 대 한 수정 하는 것이 중요. 이는 호모 dimeric 참조 단백질^23,24 한 색상 sFCS 또는 번호를 사용 하 여 밝기와 밝기 (N & B)를 측정 하 여 일반적으로 수행 됩니다.