이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.
생물 학적 과정의 다양 한 일반적으로 인접 셀 간의 인터페이스에 상호 작용 하는 단백질에 의해 중재-세포 상호 작용을 포함 한다. 관심,만 몇 가지 분석의 특히 살아있는 세포에 직접 그런 상호 작용 할 수 있다. 여기, 선물이 표현-셀 연락처에 이웃 세포의 표면에 단백질의 바인딩을 측정 하는 시험. 이 분석 결과 두 단계로 구성 됩니다: confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 셀 연락처에서 형광 변동 분광학 측정 뒤에 다른 형광 단백질을 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 혼합. 우리 셀 접속점에 걸쳐 녹말 체 선구자 같은 단백질 1 (APLP1)의 상호 작용을 측정 하 여 생물학으로 관련 된 맥락에서이 분석 결과의 타당성을 보여줍니다. 우리는 형광 기반 기술 (형광 교차 상관 분광학, 교차 상관 번호와 밝기 분석 검사)를 사용 하 여 필요한 악기 교정 데이터 수집에 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 우리는 데이터 분석 및 식별 하 고 외부, 스 퓨 리 어스 신호 변이 때문에 photobleaching 또는 셀 운동 등을 수정 하는 방법에 중요 한 단계를 논의.
일반적으로 제시 분석 결과 호모-또는 같은 또는 다른 종류의 셀 사이의 셀 연락처에서 heterotypic 단백질-단백질 상호 작용에 적용 하 고 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 구현 될 수 있습니다. 중요 한 요구 사항은 몇 분 동안 관심사의 단백질의 방산 역학 조사 하기에 충분 해야 하는 시스템의 안정성 이다.
많은 생물학 과정 세포 세포 상호 작용, 예를 들어, 셀 접착1,2,3, 셀 셀 퓨전4 및 세포 인식5사이트에서 발생합니다. 이러한 이벤트는 특히 중요 한 다세포 생물의 세포-세포 커뮤니케이션, 예를 들어, 면역 반응 동안에 대 한 개발 중입니다. 이 프로세스는 일반적으로 즉, 이웃 세포의 원형질 막 (오후)에 표면에 지역화 되 고 규제에서 공간과 시간을 정확 하 게 세포 세포 접촉에서 특정 상호 작용을 받을 단백질에 의해 중재 됩니다. 대부분의 경우에서 이러한 상호 작용 직접 호모-또는 heterotypic 단백질-단백질 트랜스 상호 작용, 하지만 또한 이온 또는 extracellular 링커1로 작동 하는 ligands를 포함 될 수 있습니다. 비록 기본적인 중요성의, 살아있는 세포의 기본 환경에서 직접 이러한 특정 단백질-단백질 상호 작용을 조사 하는 분석 실험의 부족이 이다. 많은 방법 중 필요 셀 중단 (예, 생 화 확 적인 분석 실험 공동 immunoprecipitation6등), 고정 (예를 들어, 일부 최고 해결책 광학 현미경 검사 법 기술과 세포-세포의 전자 현미경의 7연락처), 또는 일반적인, 예를 들어, 집계 / 접착 분석 실험8,9. 이 문제를 해결 하려면 형광 기법 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)10 또는 형광 보완성11기반으로 구현 되었습니다. 그러나, fluorophores 사이 충분히 작은 거리를 위해 이러한 메서드는 단백질10, 트랜스 상호 작용을 잠재적으로 방해의 extracellular 측에 형광 라벨 필요 합니다.
여기, 우리 셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 대체 형광 기반 분석 결과 제시. 이 방법은 결합 형광 크로스-상관 관계 접근 (검색 형광 교차 상관 분광학 (sFCCS), 교차 상관 번호와 밝기 (ccN & B))의 단백질의 융합 개념을 표현 하는 셀의 혼합 관심, 예를 들어, 접착 수용 체. 두 개의 상호 작용 세포에 조사 수용 체는 세포내에서 2 개의 괴기 하 게 분리 된 형광 성 단백질 (FPs), 표시 됩니다 ( 그림 1A참조) 사이드.
고용된 방법 confocal 레이저 스캐닝 현미경의 초점 볼륨을 통해 형광 성 융해 단백질의 방산 움직임에 의해 유도 된 형광 변동에 대 한 통계 분석을 기반으로 합니다. 더 자세히 분석 결과 프로브 셀 연락처에서 두 이웃 PMs에 관심사의 단백질의 공동 보급 합니다. 단백질 트랜스 상호 작용을 받을 경우이 트랜스 단지 두 스펙트럼 채널에 방출, 두에 미터의 상관된 형광 변화를 일으키는 형광 단백질을 수행 한다. 다른 한편으로, 아무 바인딩 경우 PMs를 직면 하 고 있는 단백질의 번호 변동 독립, 아무 상관된 변동 원인이 될 것입니다. 인수는 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 1) sFCCS-셀 접촉에서 선 모양의 검사에 근거 하 고 효과적으로 접촉 지역에 위치한 자리에 상호 작용을 조사. 형광 변화의 시간적 분석을 통해 sFCCS 또한 역학 정보를 제공 한다 즉, 단백질 복합물;의 확산 계수를 2) ccN & B 세포 세포 접촉 지역에서 취득 하는 이미지의 시퀀스에 대 한 pixel-wise 분석 기반으로 합니다. 프로브 하는 기능이 고 전체 따라 지도 상호 작용 영역 (하나의 초점 비행기), 문의 하지만 역학에 정보를 제공 하지 않습니다. 두 가지 방법, 즉, 평균 형광 신호 시간 단위에 단일 확산 단백질 복합물에 의해 방출 하 고, 따라서,에서 단백질 복합물의 산출할의 견적을 제공 분자 밝기의 분석 결합 될 수 있다 셀 연락처입니다.
이 문서에서 우리는 상업 confocal 레이저 스캐닝 현미경에 제시 분석 결과 수행 하기 위해 샘플 준비, 계측기 교정, 데이터 수집 및 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 모든 악기와 광자 계산 또는 아날로그 탐지기 높은 숫자 조리개와 목표에 실험을 수행할 수 있습니다. 우리 또한 프로토콜의 중요 한 단계를 토론 하 고 artefactual 신호 변동, 예를 들면, 감지기 소음, photobleaching 또는 셀 운동 발생 하는 여러 프로세스에 대 한 수정 계획을 제공 합니다. 원래 부착 세포 간의 상호 작용을 개발, 분석 결과 현 탁 액 셀을 수정할 수 있습니다 또는 적응 모델 멤브레인 시스템, 예를 들면, 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs) 또는 거 대 한 플라즈마 막 소포 (GPMVs), 수는 상호 작용 다른 지질 환경에서 또는 조직된 골격12,13의 부재에서 부 량이 고
형광 교차 상관 분광학 검색 형광 교차 상관 분광학14 의 수정된 된 버전 이며, 지질 막15의 느린 방산 역학 조사 하도록 특별히 설계 되었습니다. 그것은 관심의 형광 단백질을 포함 하는 오후에 수직 라인 스캔 수집을 기반으로 합니다. 2 개의 다르게 분류 단백질의 상호 작용을, 인수 spectrally 분리 fluorophores에 대 한 두 개의 레이저 라인 및 2 개의 검색 창을 사용 하 여의 스펙트럼 채널 두 개에서 수행 됩니다. 때문에 오후에 있는 단백질의 느린 유포 역학 (D≤ ~ 1 µ m2/s), 크로스 토크 무료 측정15라인을 라인에서 흥분 체계를 대체 하 여 수행할 수 있습니다. 로 시작 하는 분석: block-wise ~ 1000 라인, 2) 위치와 함께 최대 형광 신호즉, 오후, 각 블록에 위치 결정의 평균 3) 변화에 따라 측면 셀 운동 1) 정렬 알고리즘 수정 일반적인 기원12,15, 각 채널에 별도로 모든 블록의 다음, 오후에 해당 하는 픽셀의 자동 선택 모든 정렬된 라인 (즉, 센터 ± 2.5σ)의 합계의 가우스 적합에서 중앙 영역을 선택 하 여 수행 됩니다. 각 줄에 신호의 통합 수익률 막 형광 시계열 f (t) 각 채널에 (g = 녹색 채널, r = 빨강 채널). 픽셀 크기가 작은 만큼, 예를 들어, 수는 < 200 nm, 포인트의 형태를 재구성 하 기능을 확산 하 고에 해당 하는 오후의 위치는 센터. 상당한 photobleaching 존재 각 채널에서 형광 시계열 수 두 배 지 수 함수 모델링 있으며 다음 다음 수식을 사용 하 여 수정:16
. (1)
이 수식은 효과적으로 진폭 및 확산 시간 f (t)c, f (t)교정된 얻어질 것 이다 매개 변수 추정에 비해의 상관 관계 분석에서 얻은 수정 주의에 중요 하다. 다음, 자동 및 교차 상관 기능 (ACFs / CCFs) 형광의 신호 계산 됩니다:
(2)
(3)
여기서 δF나 Fi(t)-= Fi(t)
와 나 g, r=.
2 차원 확산 모델은 다음 모든 상관 관계 기능 (CFs)에 장착 되어:
. (4)
여기, N 각 채널에 대 한 확산 시간 관찰 볼륨과 τd 에 형광 단백질의 수를 나타냅니다. 이 모델 고려는 설명된 실험 설정에서 x-z 평면에서 발생 하는 오후에 있는 단백질의 유포 형광 상관 관계의 일반적으로 사용 되는 구성 달리 분광학 (FCS) 실험 조사 하는 세포 막에 confocal 볼륨17의 x y 평면에서 보급. 허리 w0 와 구조 인자 S, 설명 하는 신장 z, S에에서 초점 볼륨의 wz = wz/w0, 괴기 하 게 비슷한 염료와 같은 광학 설정 포인트 FCS 교정 측정에서 얻을 수 있습니다 이미 사용 가능한 값을 사용 하 여 확산 계수에 대 한 D염료:
(5)
τd, 염료는 피팅 데이터를 3 차원 확산에 대 한 모델에서 얻은 염료 분자의 측정 된 평균 보급 시간에 분수 모든 N 분자의 T 의 계정 전환으로 복용 한 시간 상수와 triplet 상태 ττ:
. (6)
마지막으로, 확산 계수 (D), 분자 명도 값 (ε) 및 sFCCS 데이터 (rel.cc.)의 상대 교차 상관은 다음과 같이 계산 됩니다.
(7)
(8)
(9)
어디 간 상관 함수의 진폭은 G크로스(0)와 i-번째 채널의 자기 상관 함수의 진폭은 이다.
이 정의 상대 교차 상관, 즉 의 최대 수식 9에 의미 를 대신 사용 하 여 고려는 단지 두 개의 단백질 종의 다양 한 농도의 최대 수에 의해 제한 됩니다는 낮은 번호에 종입니다.
교차 상관 수와 밝기 기반 샘플에서 고정된 위치에서 시간이 지남에 인수는 이미지 스택의 각 픽셀에 대 한 형광 강도의 순간 분석 일반적으로 100 ~ 200의 구성 된 프레임, 2 개의 스펙트럼 채널 ( g = 그린 채널, r = 빨강 채널). 시간적 의미에서 나
나 및 분산
, 분자 밝기 εi 및 숫자 n나 각 픽셀에 스펙트럼 채널 계산 됩니다 (나 = g, r)18:
(10)
. (11)
그것은 진정한 광자 계수 검출기의 이상적인 경우에는 주어진된 방정식 적용 해야 합니다. 아날로그 탐지 시스템에 대 한 다음 방정식19,20적용:
(12)
. (13)
여기, S는 감지 된 광자와 기록된 디지털 카운트 사이의 변환 계수 판독 소음 및 오프셋 검출기 강도 오프셋을 나타냅니다. 일반적으로, 이러한 수량 해야 될 보정, 꾸준한 조명19, 예를 들어, 반사 금속 표면 또는 말린된 염료 솔루션에 대 한 강도의 기능으로 측정 하는 검출기 편차에 따라 모든 검출기 종류에 대 한. 오프셋 은 여기 빛 없이 샘플 카운트 속도 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 검출기 관련 분산의 선형 회귀를 수행 하 여
(나) 강도 플롯, S 대와
결정된19일 수 있다:
. (14)
마지막으로, 교차 상관 밝기 각 픽셀에 계산 되 고21 으로 일반적 정의
(15)
어디 크로스-분산은
.
수명이 긴 동요를 필터링 하기 위해 모든 ccN & B 계산 수행 됩니다 다음 필터링 하지, 독립적으로 각 픽셀22기차. 간단히, ni, ε난 (나 = g, r)와 Bcc 슬라이딩의 예를 들어, 세그먼트 8-15 프레임에서 계산 됩니다. 이렇게 얻어진 값은 다음 값을 가져올 최종 픽셀 수와 밝기 평균 수 있습니다.
산출할 분석
셀 연락처에서 단백질 복합물의 산출할을 추정 하기 위해서는 분자 밝기는 sFCCS 또는 ccN & B 데이터에 대 한 각 스펙트럼 채널에 별도로 분석할 수 있습니다. SFCCS에서 한 명도 값 측정 각 채널에서 당 얻은 것입니다. CcN & B, 셀 연락처에 해당 하는 모든 픽셀의 밝기 히스토그램 취득 하 고 평균 (또는 평균) 값 측정을 위한 대표적인 밝기로 사용할 수 있습니다. 단위체 참조에 동일한 분석을 수행 하 여 모든 명도 값 감지 단백질 복합물의 평균 oligomeric 상태를 직접 정규화 될 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 oligomeric 상태의 과소에 발생할 수 있는 비 형광 FPs의 존재에 대 한 수정 하는 것이 중요. 이는 호모 dimeric 참조 단백질23,24 한 색상 sFCS 또는 번호를 사용 하 여 밝기와 밝기 (N & B)를 측정 하 여 일반적으로 수행 됩니다.
여기에 설명 된 실험 절차-셀 연락처, 형광 변동 분광학 기술을, 즉 sFCCS 및 ccN & B에서 트랜스 상호 작용 단백질-단백질의 조사를 수 이러한 방법은 두 괴기 하 게 분리 된 FPs 하나 또는 다른 융해 단백질을 표현 하는 각각 두 개의 인접 셀의 연락처에 대 한 관심의 protein(s) 융합에 의해 방출 되는 형광 변동에 대 한 통계 분석을 포함 한다. 트랜스 복합물의 존재는 이웃 PMs에서 단백질의 …
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 부분적으로 도이치 가운데 (DFG)에 의해 지원 254850309를 부여. 저자는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Madlen Luckner 감사합니다.
DMEM growth medium | PAN-Biotech | P04-01548 | |
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ | PAN-Biotech | P04-36500 | |
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ | PAN-Biotech | P04-35500 | |
Trypsin EDTA | PAN-Biotech | P10-023100 | |
TurboFect Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
HEK 293T cells | DSMZ | ACC 635 | |
Alexa Fluor 488 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A20000 | |
Rhodamine B | Sigma-Alderich | 83689-1G | |
Plasmid DNA | Addgene | NA | See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids |
6-well plate | Starlab | CC7672-7506 | |
35-mm glass bottom dishes | CellVis | D35-14-1.5-N | |
Zeiss LSM780 confocal | Carl Zeiss | NA | |
MATLAB software package | MathWorks | 2015b | |
Neubauer cell counting chamber | Marienfeld | 640110 |