Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

Mange biologiske processer forekommer ved lokaliteter af celle-celle interaktioner, f.eks. celle-celle vedhæftning^1,2,3, celle-celle fusion⁴ og cellular anerkendelse⁵. Sådanne begivenheder er særlig vigtigt i forbindelse med udviklingen af flercellede organismer og cell-celle kommunikation, fx under immunrespons. Disse processer er typisk formidlet af proteiner, der er lokaliseret på overfladen, dvs, på plasma membran (PM) af tilstødende celler og underkastes specifikke interaktioner på celle-celle-kontakt, der er præcist reguleret i tid og rum. I mange tilfælde disse interaktioner er direkte homo- eller Heterotypiske protein-protein trans interaktioner, men kan også involvere ioner eller ligander som ekstracellulære linkers¹. Selv om af grundlæggende betydning, er der en mangel på assays sondering disse specifikke protein-protein interaktioner direkte i native miljøet af levende celler. Mange metoder enten kræve celle forstyrrelser (fx, biokemiske analyser som co-immunoprecipitation⁶), fiksering (f.eks. nogle af super-resolution Optisk mikroskopi-teknikker og elektronmikroskopi af celle-celle kontakter⁷), eller er ikke-specifikke, fx sammenlægning / vedhæftning-undersøgelser,^8,9. For at afhjælpe dette problem, er blevet gennemført fluorescens teknikker, baseret på fluorescens resonans energi overførsel (FRET)¹⁰ eller fluorescens komplementering¹¹. Disse metoder kræver dog, for at opnå tilstrækkelig små afstande mellem fluorophores, fluorescerende etiketter på den ekstracellulære side af proteiner¹⁰, potentielt forstyrre trans interaktioner.

Her præsenterer vi en alternativ fluorescens-baseret analyse for protein-protein interaktioner på celle-celle kontakter. Denne metode kombinerer fluorescens cross-korrelation tilgange (scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi (sFCCS), kors-sammenhæng antallet og lysstyrke (ccN & B)) og blanding af celler, der udtrykker en fusion konstruktion af protein af interesse, fx en vedhæftning receptor. De undersøgte receptorer i de to interagerende celler er mærket med to spektralt adskilt fluorescerende proteiner (FPs), fra den intracellulære side (Se figur 1A).

De erhvervsdrivende metoder er baseret på den statistiske analyse af fluorescens udsving induceret af diffuserende bevægelse af fluorescerende fusion proteiner gennem den fokale volumen af en Konfokal laser scanning mikroskop. Mere detaljeret sonder analysen Co udbredelsen af proteiner af interesse i både nærliggende PMs på celle-celle kontakter. Hvis proteinerne undergår trans interaktioner, vil disse trans komplekser bære fluorescerende proteiner udsender i begge spektrale kanaler, forårsager korreleret fluorescens udsving af begge udledere. På den anden side, hvis ingen bindende opstår, vil de nummer udsving af proteiner i forbindelse med PMs være uafhængige, forårsager ingen korreleret udsving. Erhvervelsen kan udføres på to måder: 1) sFCCS er baseret på en linie-formede scanning på tværs af celle-celle-kontakt og effektivt sonder interaktioner i et spot, beliggende i regionen kontakt. Gennem en tidsmæssig analyse af fluorescens udsving giver sFCCS også dynamics oplysninger, dvs., diffusion koefficienterne af proteinkomplekser; 2) ccN & B er baseret på en pixel-wise analyse af en sekvens af billeder erhvervet på celle-celle kontakt regioner. Det har evnen til at probe og kort interaktioner langs hele kontakte region (i en fokalplan), men indeholder ikke oplysninger om dynamik. Begge metoder kan kombineres med en analyse af den molekylære lysstyrke, dvs, gennemsnitlige fluorescens signalet udsendes i enheden af enkelt spreder proteinkomplekser og således give et skøn over støkiometrisk af proteinkomplekser på celle-celle kontakter.

I denne artikel leverer vi detaljerede protokoller for prøveforberedelse, instrument kalibrering, dataopsamling og analyse til at udføre præsenteres analysen på en kommerciel Konfokal laser scanning mikroskop. Forsøgene kan udføres på ethvert instrument udstyret med photon optælling eller analog detektorer og et mål med høj numerisk blænde. Vi videre diskutere kritisk trin i protokollen og give korrektion ordninger for flere processer, der forårsager artefactual signal udsving, fx detektor støj, photobleaching eller celle bevægelse. Oprindeligt udviklet til at probe interaktioner mellem vedhængende celler, analysen kan ændres for affjedring dataceller eller tilpasset model membran systemer, fx giant unilamellar vesikler (GUVs) eller kæmpe plasma membran vesikler (GPMVs), så den kvantificering af interaktioner i forskellige lipid miljøer eller i mangel af en organiseret cytoskeleton^12,13.

Scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi er en modificeret version af fluorescens cross-korrelations-spektroskopi¹⁴ og var specielt designet til at probe langsom diffuserende dynamics i lipid membraner¹⁵. Det er baseret på en line scan erhvervelse vinkelret på PM indeholdende de fluorescerende proteiner af interesse. For at sonde vekselvirkninger mellem to anderledes mærket protein arter, udføres erhvervelse i to spektrale kanaler ved hjælp af to laser linjer og to påvisning windows for spektralt adskilte fluorophores. På grund af den langsomme diffusion dynamics af proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2/s), en cross-talk-fri måling kan udføres ved vekslende excitation ordningen fra linje til linje¹⁵. Analysen starter med: 1) en justering algoritme korrigere for laterale celle bevægelse baseret på block-wise gennemsnit af ~ 1000 linjer, 2) bestemmelse af position med maksimal fluorescens signaldet vil sige, PM position, i hver blok og 3) skiftende af alle blokke til en fælles oprindelse^12,15, separat i hver kanal. Derefter udføres en automatisk valg af pixels svarende til PM ved at vælge den centrale region fra en Gaussisk pasform af summen af alle linje linjer (dvs. center ± 2.5σ). Integration af signalet i hver linje udbytter membran fluorescens tidsserien f(v) i hver kanal (g = grøn kanal, r = rød kanal). Bemærk, at pixelstørrelse har at være lille nok, f.eks < 200 nm, at rekonstruere form af punkt spredt funktion og finde sin center, svarende til placeringen af PM. Ved tilstedeværelse af betydelige photobleaching, fluorescens tidsserier i hver kanal kan modelleres med en dobbelt-eksponentiel funktion og derefter korrigeres med følgende formel:¹⁶

.    (1)

Det er vigtigt at bemærke, at denne formel effektivt korrigerer både amplituder og diffusion gange korrelation analysen af f(v)^c, sammenlignet med parameteren skøn, der ville være opnået fra den ukorrigeret f(v). Derefter, auto – og cross-korrelation funktioner (ACFs / CCFs) af fluorescens signaler beregnes:

, (2).

, (3).

hvor δF_jeg = F_jeg(t) – , F,_jeg(t) og jeg = g, r.

En to-dimensionel diffusion model monteres derefter at alle korrelation funktioner (CFs):

.   (4)

Her, angiver N antallet af fluorescerende proteiner i observation volumen og τ_d diffusion tid for hver kanal. Denne model tager hensyn at i indstillingen beskrevet eksperimentelle diffusion af proteiner i PM opstår i x-z planet, i modsætning til den anvendte konfiguration af fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) eksperimenter på membraner sondering Diffusion i x-y plane Konfokal bind¹⁷. Taljen w₀ og struktur faktor S, der beskriver brudforlængelse w_z af fokale volumen i z, S = wz/w₀, er fremstillet af et punkt FCS kalibrering måling udført med samme optiske indstillinger og spektralt lignende farvestoffer ved hjælp af allerede tilgængelige værdier for diffusion koefficient D_farvestof:

, (5).

hvor τ_{d, farvestof} er den målte gennemsnitlige diffusion tid af farvestof molekyler, fremstillet af montering af en model for tre-dimensionelle diffusion til data, under hensyntagen til konto overgange i en brøk T af alle N molekyler til en triplet stat med en gang konstant τ_τ:

.   (6)

Endelig, diffusion koefficienter (D), Molekylær lysstyrkeværdierne (ε) og den relative cross-samkøring af sFCCS data (rel.cc.) beregnes som følger:

, (7).

, (8).

, (9).

hvor G_cross(0) er amplituden af cross-korrelationsfunktionen og er amplituden af funktionen autokorrelation i jeg-th kanal.

Denne definition af den relative Kors-sammenhæng, dvs bruger max i stedet for at betyde i ligning 9, tager i betragtning, at det maksimale antal komplekser af to protein der forekommer i forskellige koncentrationer er begrænset af den arter, der forekommer i et lavere tal.

Kors-sammenhæng antallet og lysstyrke er baseret på et øjeblik analyse af fluorescens-intensiteten for hver pixel i en billedstak erhvervet over tid til en fast stilling i stikprøven, typisk bestående af ~ 100-200 billeder, med to spektrale kanaler () g = grøn kanal, r = rød kanal). Fra den tidsmæssige betyder jeg_jeg og varians , Molekylær lysstyrke ε_jeg og nummer, n_jeg beregnes i hver pixel og spektral kanal (jeg = g, r)¹⁸:

, (10).

. (11)

Det er vigtigt at bemærke, at de givne ligninger gælder den ideelle sag af en ægte photon-optælling detektor. For analoge detektionssystemer gælder følgende ligninger^19,20:

, (12).

.   (13)

Her, S er omregningsfaktoren mellem fundne fotoner og de optagede digitale tællinger, er udlæsning støj og offset henviser til detektor intensitet forskydning. Generelt bør disse mængder kalibreres, for enhver detektor type, baseret på måling detektor afvigelse som funktion af intensitet for jævn belysning¹⁹, fx en reflekterende metal overflade eller tørrede farvestof løsning. Forskydning kan bestemmes ved at måle count sats for en prøve uden excitations lys. Ved at udføre en lineær regression af detektor-associerede variansen versus intensitet, (jeg) plot, S og kan være beslutsom¹⁹:

.   (14)

Endelig, cross-korrelation lysstyrke beregnes i hver pixel og defineres generelt som²¹

, (15).

hvor er cross-afvigelsen .

For at filtrere langlivede udsving, udføres alle ccN & B beregninger efter en boxcar filtrering, uafhængigt for hver pixel²². Kortvarigt, n_jeg, ε,_jeg (jeg = g, r) og B_cc beregnes i glidende segmenter af fx 8-15 frames. De dermed opnåede værdier kan derefter gennemsnit for at opnå den endelige pixel antallet og lysstyrken værdier.

Støkiometrisk analyse
For at kunne vurdere støkiometrisk af proteinkomplekser på celle-celle kontakter, kan den molekylære lysstyrke analyseres separat i hver spektrale kanal for sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS opnås en lysstyrkeværdi pr. maaling i hver kanal. CcN & B, en lysstyrke histogram af alle pixels svarende til celle-celle-kontakt er opnået og den gennemsnitlige (eller median) værdi kan bruges som repræsentative lysstyrke til måling. Ved at udføre den samme analyse på en monomere reference, kan alle lysstyrkeværdierne normaliseres du kan direkte hente den gennemsnitlige oligomere stat af de fundne proteinkomplekser. På dette tidspunkt, er det vigtigt at korrigere for tilstedeværelsen af ikke-fluorescerende FPs, som kan resultere i en undervurdering af den oligomere stat. Dette er typisk udføres ved at måle lysstyrken af en homo-dimerisk reference protein^23,24 ved hjælp af en farve sFCS eller antal og lysstyrke (N & B).