JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Published: November 05, 2018
doi:
10.3791/58538
, , ,
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry,University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry,University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry,University of Alberta

Summary

Здесь мы представляем, как небольшой угол рентгеновского рассеяния (лучей) могут быть использованы для получения информации о низком конверты, представляющие макромолекулярных структур. При использовании в сочетании с высоким разрешением структурные методы, такие как рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса, лучей может предоставить подробную взглянуть на многодоменных белков и макромолекулярных комплексов в решение.

Abstract

Белок белковых взаимодействий с участием белки с несколькими доменами, шаровидных представляют технические проблемы для определения формы как такие комплексы и как домены, ориентированные позиционируется. Здесь описывается протокол с потенциалом для выяснения какие домены посредником взаимодействий в многокомпонентной системы через ab initio моделирования. Метод для вычисления решения структур макромолекул и их сборки обеспечивается, что предполагает интеграцию данных из малоуглового рентгеновского рассеяния (лучей), хроматография и атомной резолюции структур вместе в гибридный подход. Конкретным примером является то, что комплекса полнометражные nidogen-1, который собирает белков внеклеточного матрикса и образует расширенное, изогнутые наноструктур. Один из своих шаровидных доменов придает Ламинин γ-1, который структурирует базальной мембраны. Это обеспечивает основу для определения точной структуры гибкие многодоменных белковых комплексов и включаемые источники синхротронного, в сочетании с робототехники и размер исключения хроматографии автоматики. Эта комбинация позволяет быстрый анализ, в котором несколько государств олигомерных отделены только до сбора данных лучей. Анализ дает информацию о Радиус инерции, измерение частиц, молекулярные формы и укорачивания сопряжения. Протокол для создания 3D-модели комплексов путем установки с высоким разрешением структуры белков компонент также предоставляется.

Introduction

Ячейки содержат сложные сети белков, которые действуют как молекулярные машины клеточных функций таких как сигнальные каскады и сохранение структурной целостности. Каким образом эти различные компоненты двигаться и взаимодействовать в трехмерном пространстве порождает конкретные функции макромолекул. Важность структуры белков, динамики и взаимодействия в определении функции обеспечивает потребность в постоянно меняющихся и сложных методов для измерения этих свойств. Из них ядерного магнитного резонанса (ЯМР), рентгеноструктурного анализа (XRC) и более недавно, крио-электронная микроскопия (CEM) предоставляют высоким разрешением структурную информацию. Однако XRC и сем выход одного из многих государств биомолекулярных структур и отсутствие информации о динамике структуры белков, в то время как определение 3D структура ЯМР обычно ограничивается меньше Глобулярные белки. Одним из путей преодоления этих ограничений является использовать небольшой угол рентгеновского рассеяния (лучей) для создания молекулярных конверты больших многодоменных complexed систем и объединить с высоким разрешением жестких макромолекулярных структур для выяснения глобальной Архитектура и динамические возможности.

ЛУЧЕЙ производит разрешением конверты макромолекулярных комплексов с разрешением примерно 10-20 Å 1, давая понять не только в структуре, но и динамические характеристики, которые отображает комплекс. Хотя лучей использует рентгеновские раскрыть молекулярной структуры, это в отличие от XRC, в том, что случайные изотропной ориентации частиц в растворе не привести дифракции, а скорее рассеяния, который не может принести атомные резолюции. Вместо этого электрона «конверт» макромолекулы генерируется который представляет в среднем по конформации, отображаемых макромолекулы. Эта информация может использоваться в прямой фитинг ранее выполнено атомной резолюции структур вывести регионы гибкость в подразделения Организации или одного белка, или динамика в комплексе больше, мульти белка. ЛУЧЕЙ данные собираются в synchrotrons, использование высокоэнергетических монохромные рентген или из внутренних источников, которые предлагают слабее источник рентгеновских лучей, требующих часов, вместо того, чтобы секунд времени экспозиции образца (рис. 1). ЛУЧЕЙ данных часто собирается из нескольких образцов с одной экспериментальной установки и буфера, требующие длительного времени собирать серию полезных данных в системе. Образцы поэтому следует стабильной и не агрегирование для по крайней мере несколько часов, основанные на проверке качества методы, такие как Динамическое рассеяние света (DLS) и/или анализ аналитической ультрацентрифугирования (AUC)) для получения высокого качества лучей данных2 , 3. здесь мы предоставляем практическое описание лучей, принципы ее использования, выгоды, ограничения и Пробоподготовка и фокус на сбора и анализа данных, наряду с трогательной кратко на ab initio моделирования с использованием белков внеклеточного матрикса nidogen-1 и Ламинин γ-1 в качестве примера экспериментальный.

Принципы, преимущества и ограничения лучей:

Руководящие принцип(ы) позади лучей относительно прост: решение монодисперсными подготовки macromolecule(s) интерес помещается внутри капилляра и подвергается высокой энергии монохромные рентгеновского пучка. Фотоны вызывают электронов атомной раковины начать колеблющихся, что приводит к сферической волны излучаемых же энергии и волны. Поскольку каждый электрон будет колебаться, постоянное фон будет достигнуто, и результирующая концентрация электронов макромолекулы контрастируют на фоне. Результате рассеяния интенсивности собирается как функция угол рассеяния, 2Θ (рис. 1).

То время как другие методы такие как XRC, ЯМР и CEM обеспечивают структурную информацию на атомном уровне, есть несколько преимуществ для лучей, что другие методы не может обеспечить. ЛУЧЕЙ может быть выполнена в почти любой буфер и не требует каких-либо специальных пробоподготовки. Это особенно важно в изучении поведения и структуре макромолекул в различных условиях, таких, как наличие или отсутствие моно – или двухвалентной катионы или изменения рН4,5. ЛУЧЕЙ имеет возможность предоставлять информацию о гибких регионах макромолекулы6, то другие перечисленные методы могут бороться с. Таким образом лучей может использоваться как сильный бесплатными техника с стабильной части макромолекул, изучал с XRC, NRM или джем и весь макромолекулы или сложных проанализированы в низком разрешении с лучей и комбинировать с помощью различных инструментов анализа таких как FoXSDock7 или8CRYSOL. Так как лучей техника решения, он часто используется для подтверждения, если статическая структур, таких как полученные от XRC согласуются в решение6. ЛУЧЕЙ также имеет преимущество технику, которая требует сравнительно небольшое количество образцов инвестиций (обычно 50-100 мкл) и относительно небольшое количество времени эксперимент (30 мин.-1 ч).

Крупнейшим ограничение лучей является уязвимость к статистической выборки и/или деградации, которая может привести к неправильным структурный прогнозы. Агрегат, даже как низкий, как 5%, можно рассеивают свет в очень больших количествах, приводит к завышению максимальная частица аспекта (DМакс) и Радиус инерции (Rg). С другой стороны пример деградация может привести к занижен молекулярных свойств. Эта уязвимость возникает из лучей, будучи метод усреднения, это означает, что образец однородности имеет решающее значение для достижения надежных и воспроизводимых результатов. Любой образец, который должен быть проанализирован лучей должен таким образом, пройти несколько методов очистки и проверки однородности, например денатурируя и родной гель-электрофорез, размер гель-проникающей хроматографии, динамического рассеяния, света и аналитических Ultracentrifugation. Часто лучей излучение будет работать, что образцы через жидкостной хроматографии высокой производительности как конечный контроль качества шаг до лучей (S-лучей)3,9. ЛУЧЕЙ данные должны быть собраны в несколько концентрациях и должны сравниваться Rg каждого набора данных, обеспечивая близкое сходство, чтобы избежать interparticle взаимодействия и агрегации, что приводит к завышению частицы размеры, ведет к неточности данных анализа и моделирования. Так как рассеяния зависит от концентрации и размер, меньше макромолекул может потребовать более конкретные оптимизации диапазон концентраций. Это обусловлено Взаимности Теорема, где большие размеры разброса на малые углы и небольшие размеры к большие углы. Это проявляется в области сбора данных, где яO пропорциональна6R, где R — радиус частиц. Ограничением окончательный лучей является потенциал нанесения ущерба излучения к образцу во время экспозиции, которая может привести к искажению данных. Это хорошая практика, чтобы сравнить качество образца до и после воздействия лучей образца чтобы убедиться, что это не происходит.

Protocol

1. лучей образец подготовки и сбора данных Подготовка образца: ЛУЧЕЙ эксперименты требуют образцы протеина однородной, стабильной и не агрегирования; наблюдать за стабильность и олигомерные государства с размер гель-проникающей хроматографии (S), DLS или AUC до сбора данных. Тема образцов (nidogen-1 и Ламинин γ-1 в данном случае) DLS анализа и Трицин SDS-PAGE для визуализации образца чистоты10.Примечание: Образцы могут охватывать широкий спектр концентрации (1-4 мг/мл) в зависимости от их размера, их решение поведение как самостоятельной ассоциации и агрегации, а также стабильности; здесь пять концентрации nidogen-1, (139 кДа), три Ламинин γ-1 (109 кДа) и четыре S-очищенная эквимолярных комплекса были подготовлены как описано10. Сбор данных: Сбор данных лучей с помощью собственной системы или синхротрон, согласно рекомендациям изготовителя или объекта.Примечание: Данные, используемые в этой работе была собрана с помощью внутренней системы (см. Таблицу материалы), содержащий с 3-точечным камеру + 002 излучения запечатанный пробки (Cu Kα излучения на 1,54 Å) и оптика конфокальный Макс-Flux (CMF), работающих на 40 Вт. Система также оснащена 200 Нм Многопроволочная 2D детектор для сбора данных. Однако с наличием современных synchrotrons во Франции, Германии, Великобритании, США и других странах, которые обеспечивают доступ к настройке S-лучей, что облегчает разделение монодисперсными подготовки от возможного агрегирования/деградации, мы теперь регулярно сбор данных на объектах синхротрона. Недавно опубликованные статьи о ДНК G-четырехместных11 является примером стратегии сбора данных S-лучей. В этом случае, были собраны данные лучей в диапазоне от 0,08 ≤ q ≤ 0.26 Å за 3 часа для nidogen-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 и 4.0 мг/мл); Ламинин γ-1 (1,5, 2,0 и 2,5 мг/мл) и их комплекс (0.8, 1.0, 1,25 и 1,5 мг/мл). Уменьшите данных буфера и примеры использования программного обеспечения обработки, относящиеся к системе. Вычтите буфер вклад от белка данных с помощью программы как PRIMUS/qt12 (рис. 2A). 2. анализ данных Примечание: В настоящее время, есть несколько пакетов программного обеспечения, которые являются полезными для анализа данных лучей: ScÅtter43 (скачать на www.bioisis.net), bioXtas сырье44и ATSAS номер13. Этот раздел содержит обзор общих шагов необходимо принимать при анализе сырья лучей данных с использованием ATSAS программа люкс и конкретные шаги из ATSAS 2.8.1 скачать. Другие программы могут быть использованы и кратко обсуждаются позже. Вычитание буфераПримечание: Эти шаги являются актуальными для статических лучей образцов только. Выберите параметр меню «Открыть» в PRIMUS/qt и выберите интересующие файлы данных. Имейте в виду, что данные файлы должны быть в формате ASCII, в котором первый столбец является осью s вектор и второй столбец является интенсивность. Повторите этот шаг для данных, собранных для самого буфера, вставляя эти данные в том же меню. Выберите «Вычитание» в окне обработки данных, который будет генерировать вычитается рассеяния кривую, представляющую только рассеяния от макромолекулы интерес. Повторите этот шаг для каждой концентрации. Guinier анализ Чтобы выполнить анализ Guinier, нагрузка буфера вычитается точечная кривая в PRIMUS/qt, как описано в шаге 2.1.1. Нажмите кнопку «Радиус инерции», которая будет проходить в открытии мастера Примус Guinier; участок ln(I) против q2 будет отображаться. Для получения предварительных Rg используйте функцию «AUTORG», которая является внешний модуль построен в PRIMUS/qt. найти кнопку «Autorg» и щелкните его. Ввод нескольких файлов одновременно, выделив их всех и вставляя их в меню с правой стороны, очень похож на 2.1.1. Используйте Guinier сюжет, созданный ранее для оценки качества данных; Зеленая линия под Guinier сюжет показывает остатков участок, представляющий линейность fit. Имейте в виду, что нелинейность в Guinier анализе может быть признаком образца агрегации и дальнейшего анализа в этом случае не должно выполняться.Примечание: Линейный Guinier fit дает Rg с небольшой ошибкой (< 5%) и предлагает образец высокого качества. Kratky анализ Загрузите данные визуализируются в подобной манере, как описано выше. Нажмите на «Выберите поле» рядом с имя файла данных. Это будет участок данных в отдельном окне. Нажмите на кнопку «Участок», следуют выбор «Kartky участок» в раскрывающемся меню. Это будет участок данные как «q2 x L(q) против q». Имейте в виду, что Глобулярные белки отображение Гаусса пик, в то время как разворачивались белки будет отображать плато вместо пик и напоминают гиперболических участок17. Слияние данных Нагрузка буфера вычитается данные для каждого концентрации в PRIMUS/qt еще раз, как в шаге 2.1.1. Для объединения данных, просто нажмите на кнопку «Слияние» в окне Обработка. Осмотрите каждую кривую и я шкала номер, который коррелирует с разведения из исходного образца.Примечание: Образцы в более высокой концентрации отображать меньше шума в регионе хвост кривых. P(r) распределение Для создания P(r) сюжет, загрузки данных слияния кривых в PRIMUS/qt как описано ранее. Нажмите на кнопку «Расстояние распределение», чтобы открыть новое окно, представляя объединенные данные интенсивности рассеянного света против q и пара расстояния распространения функция участка на правой стороне.Примечание: Информация на правой стороне представляет общее качество пара расстояние распространения функция вычисления. Отрегулируйте диапазон данных слияния данных, чтобы избежать любой значительный шум на хвосте необработанных данных. Опустите точек данных, недалеко от остановки луча в регионе низкий q. Чтобы определить DМакс, Начните с широкий спектр ~ 5 раз Rg полученные из анализа Guinier. Постепенно уменьшить это значение до тех пор, пока P(r) сюжет не резко упадет до нуля на оси y и не имеют длинный хвост перед приближается к нулю. Проверьте, что экспериментальный Rg/я0 (производное от Guinier приближение) и P(r) Rg/я0номера похожи.Примечание: В некоторых случаях дальнейшие манипуляции на диапазон данных, точки данных и альфа (Регуляризация параметр, который сообщает программе, что отношение как много внимания уделяется гладкость распределения, по сравнению с монтаж экспериментальных данных) также является 21 необходимые для получения хорошего качества P(r) сюжет. 3.b initio шарик моделирования и усреднения После слияния данных, собранных на нескольких концентрации, или данные, собранные с помощью S-лучей минимизируется, и были проверены Kratky сюжет, сюжет P(r) и Guinier анализа, расчета разрешением структур макромолекул и их комплексы. Этот трубопровод может использоваться для изучения структуры решения и взаимодействие нуклеиновых кислот, белков и нуклеиновых кислот белка или белок белковых комплексов10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,,3031,32 ,,33-34. Один из самых популярных программ-DAMMIN, разработанный Свергун35 и является частью ATSAS пакет13, которая использует имитации отжига протоколы с предварительного ввода информации о Rg и DМакс . Ab initio моделирования подходы и принципы описаны подробно в другом месте18,36.

Representative Results

Описанный выше подход анализа данных была использована для расчета Rg и DМакс nidogen-1, Ламинин γ-1 и их комплекс, с помощью функции P(r). Мы получили значения Rg 7.20 (±0.10) Нм, 8.10 (±0.20) Нм и 10,9 (±0, 4) Нм для nidogen-1, Ламинин γ-1 и их комплекс соответственно (рисунок 2A-B). Кроме того, значения DМакс 24 нм, 26 Нм и 35 Нм для nidogen-1, Ламинин γ-1 и их комплекс соответственно (Рисунок 2)10 были получены. Программа DAMMIF был использован для получения разрешением структуры nidogen-1 и Ламинин γ-1, который предложил, что оба белков принять расширенную форму в растворе. Значения X и НКО ЗАО НРД для nidogen-1 (~ 1 и 0,8) и Ламинин γ-1 (~0.9 и 0,8 соответственно) были также в допустимых пределах. Выравнивание с высоким разрешением структур, два домена nidogen-1 и два Ламинин γ-1, на их разрешением структур, полученные с помощью лучей допускается идентификация областей их N – и C-терминала10. Nidogen-1 была определена в качестве партнера взаимодействующих Ламинин γ-139,40 и взаимодействия сайт был сопоставлен с помощью рентгеноструктурного анализа для C-терминала доменов41. Однако с высоким разрешением структур только участвует взаимодействующих домены и не полнометражные nidogen-1 или весь Ламинин γ-1 руку. Таким образом мы очищены комплекс содержащие nidogen-1 (полная длина) и γ-1 руку Ламинин, чтобы выявить взаимодействующих регионах, а также исследование относительной ориентации N-стержня доменов обоих белков. ЛУЧЕЙ данных для комплекса принесли Rg 10.9 Нм (±0, 4) и DМакс 35 Нм. Мы использовали против получения разрешением структуры всего комплекса, который предложил, что действительно, только C-терминал региона обоих белков участвуют в посреднических взаимодействий, в то время как остальные домены являются далеко отстоят друг от друга ( Рисунок 3, видео 1). Рис. 1. Схема установки лучей. Готовится монодисперсными подготовка биомолекул или их комплексов, следуют экспозиции с высокой энергии рентгеновских лучей. В зависимости от источника (например, внутренние против синхротронного) энергии рентгеновских лучей и образец источника расстояние может варьироваться. Шаблон рассеяния рентгеновских лучей (что зависит от размера и формы биомолекул) записывается и радиально в среднем для получения 1-мерный график (1D), содержащий информацию об интенсивности рассеянного света в отношении угол рассеяния. Как буфер молекулы также рассеивают свет, вклад от этих молекул вычитаются получить шаблон рассеяния биомолекул интерес. В синхротрон, до сбора данных лучей, также обычно выполняется шаг дополнительной очистки, с помощью исключения/высокоэффективной хроматографии в линейный размер (вид сверху). Этот шаг очень важен для удаления любых агрегированных или деградированных продукт как удалить любые свободные биомолекулы от комплекса. Участок 1D рассеяния преобразуется в участок распределения пары электрон расстояние (P(r) участок), который обеспечивает радиус инерции и максимальная частица измерение биомолекул. Этот участок используется как входной файл для ab initio моделирования пакеты (т.е., DAMMIN/DAMMIF) для получения разрешением структур биомолекул, или другие пакеты (т.е. “Сасреф” / CORAL), если с высоким разрешением структура частей биомолекулы или отдельными биомолекулами комплекса известен.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. (A) участок интенсивности рассеянного света против угол рассеяния (q = 4πsinθ/λ, Нм-1) предлагая качество биомолекул (низкая область) и форму (высокая область) биомолекул. (B пары электрон расстояния распределения P(r) определяется по данным рассеяния предложить продолговатую форму биомолекул расследуется (Ламинин γ-1, nidogen-1 и их комплекс). (C) Kratky сюжет о том, что nidogen-1 и Ламинин γ-1 белки не развернулись. (D) Guinier сюжет для nidogen-1, Ламинин γ-1 и их комплекс, указывающее линейное региона для определения радиуса инерции, с использованием данных в угол рассеяния низкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рис. 3. С низким разрешением структура комплекса nidogen-1 и Ламинин γ-1 получены путем анализа слияния наборов данных с помощью программы МОНСЫ. Цветовая схема является таким же, как на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Видео 1. С низким разрешением структура nidogen-1 и Ламинин комплекс γ-1. Этот фильм был подготовлен с использованием PYMOL визуализировать различные структурные особенности комплекса. Кристаллическая структура Ламинин nidogen комплекса (PDB ID: 1NPE) показано, как лента Мультфильмы, подчеркнув взаимодействия сайтов для этого комплекса. Цветовая схема является таким же, как на рисунке 2. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Discussion

Критические шаги анализа данных лучей, изложенные в разделе протокол этой бумаги включают буфер вычитание, Guinier анализ, Kratky анализ, слияния данных и распределения P(r). Моделирование ab initio шарик слишком обширными, чтобы быть покрыты здесь в деталях и таким образом, охватывает лишь кратко.

В synchrotrons (например DESY в Германии, алмаз в Великобритании и Европейский центр синхротронного излучения во Франции), это позволяет собирать данные лучей весьма небольшую долю (~ несколько мкл) каждого образца как дроби время этого eluted из столбца s то есть подключенные в линии (см. рисунок 1 ). Упруго разрозненных данных лучей радиально составляет в среднем, используя пакеты, поставляемые изготовителем инструмента или синхротрон, прежде чем буфер вычитания может иметь место. Полученные данные 1D представляет количество рассеянного света (в, я(q)) на Y-оси и угол рассеяния (q= 4πsinθ/λ, где λ — длина волны инцидент X-лучей) и приводится на рисунке 1. Программа PRIMUS/qt12 используется непосредственно вычитать любой фон благодаря буфера и описан в разделе 1.1. Другие программы, такие как; ScÅtter43 (скачать на www.bioisis.net) с https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, и bioXtas сырье44 (доступно в https:// учебник bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) может быть использован как альтернатива ATSAS пакет.

Анализ Guinier предоставляет информацию о статистической выборки и однородности, а также предусматривающий макромолекулы интерес, на основе данных лучей от низкой s региона14Радиус инерции (Rg). Сюжет построен с PRIMUS/qt для лучей данных, полученных от каждого концентрации, следуют кривой с максимальная дальность до 1.30 для q x Rg. Пробоподготовка монодисперсными следует предусмотреть нелинейный сюжет Guinier в этом регионе (Рисунок 2D), тогда как результаты агрегата в нелинейных Guinier участок15,16. Если Guinier анализ линейной, степень «unfoldedness» макромолекулы интерес может наблюдаться с Kratky сюжет, который полезен при принятии решения для выполнения моделирования твердого тела или построить ансамбли моделей с низким разрешением. Глобулярные белки появится в Kratky заговор иметь колоколообразной кривой, в то время как расширенный молекул или разложенном пептиды появятся плато или даже увеличение больший диапазон q и отсутствие Белл формы (рис. 2 c).

Получения Rg от Guinier анализа рассматривает только точек данных из области низкой q 1 D точечной (Рисунок 2D), однако, это можно использовать практически весь набор данных для выполнения косвенного преобразования Фурье для преобразования взаимные космической информации о ln (I (q)) vs. (q) в реальном пространстве функцию распределения расстояние (P(r)) содержит информацию о DМакс и Rg (Рис. 2B) Форма участка P(r) представляет собой грубые решения конформация макромолекул интерес18,19. Преобразование взаимные космических данных в реальном космических данных является важным шагом, но подробное описание находится не в рамках настоящего документа. Таким образом обратитесь к статье20 Свергун понять каждого параметра.

Как только буфер вычитается данных при индивидуальной концентрации обрабатываются через Guinier анализ с последовательным значение Rg, следуют расследование их складной выкройку Kratky анализа, эти данные могут быть объединены. Объединенные данные для nidogen-1, Ламинин γ-1 и их комплекс обрабатывались как описано выше, и результирующая P(r) участков представлены в Рисунок 2B. В идеале один должен также вычислить функцию распределения пара расстояние P(r) для каждой концентрации для определения если лучей данные, собранные для каждого концентрации предоставляет аналогичные Rg и DМакс значения. Если Rg и DМакс остаются аналогичными в широком диапазоне концентраций, пользователь должен действовать. Следует отметить, что в зависимости от сигнала, данные могут быть усечены до слияния данных. Это часто случай при низкой концентрации и/или молекулярный вес макромолекул под следствием.

Анализ с низким разрешением формы, с помощью DAMMIN может быть выполнена в различных режимах (например быстрый, медленный, эксперт режимы и т.д.). Быстрый режим является идеальным первым шагом для оценки, если участок P(r) обеспечивает хорошее качество модели. Как правило по меньшей мере 10 модели должны быть получены для каждого участка P(r) проверить, если воспроизводимые результаты, с точки зрения структуры с низким разрешением, получаются с низкой добра подходит параметр, называемый χ (значение 0,5-1,0 считается хорошим на основании нашей обширной работы ), значение, которое описывает соглашение между экспериментально полученных данных лучей и модель, полученных данных. Для целей публикации мы обычно используют медленное или эксперт режим и рассчитать по крайней мере 15 моделей. В дополнение к DAMMIN, более быстрая версия его, DAMMIF37, а также GASBOR38 также являются альтернативами. Кроме того изучение протеин протеина или белков и нуклеиновых кислот комплексов, можно использовать против программы35, которая облегчает одновременный установку индивидуальных данных лучей для макромолекул, а также их комплекс. Для более подробной информации о расчетах с высоким разрешением модели также для исследования взаимодействия РНК белок обратитесь к недавней статье Пател et al3.

ЛУЧЕЙ теоретически простой, но несомненно метод дополняющую другие инструменты структурной биологии и результаты разрешением структурных данных, которые могут использоваться самостоятельно или в сочетании с высоким разрешением техники для выяснения информации о макромолекулярной структуры и динамики. До тех пор, как можно получить подготовку монодисперсными макромолекул и их комплексов, лучей могут быть использованы для изучения структуры в решения и взаимодействия любого типа биологических макромолекул. В случае комплекс, обсуждаемые здесь, это замечательное что меньше, чем 10% от общей доступной площади поверхности азота-1 и Ламинин γ-1 был похоронен в этом комплексе, тогда как остальная часть доменов обоих белков являются свободно доступными для взаимодействия с другими белки в внеклеточная матрица для поддержания его структурную жесткость (рис. 3). Получение такой информации для комплекса с ~ 240kDa будет очень сложным, используя другие методы структурной биологии рентгеноструктурного анализа, ЯМР и крио-EM микроскопии.

Выявление структуры белков через кристаллографии рентгеновского снимка или ЯМР является по своей природе трудоемкий процесс. Это узкое место в определении структуры является одной из областей, где лучей показывает свою силу как структурный метод; сбор данных для одного эксперимента лучей может занять менее чем за час и с помощью рациональный анализ программного обеспечения, анализ может быть сделано быстро и эффективно. ЛУЧЕЙ имеет потенциал, чтобы значительно увеличить пропускную способность структурных исследований как отдельный метод, потому что он предлагает модель с низким разрешением макромолекулярной структуры перед разрешением данных доступен. Барьер для других структурных методов является требованием для чистой, концентрированные выборки для сбора данных, который требует высокого уровня белков и стабильности в течение длительного периода времени. В то время как лучей также образцы должны быть чистой и концентрированной, образец тома находятся примерно 100 мкл, делая лучей относительно недорогой метод анализа, по сравнению с другими структурными методами. Кроме того лучей, в сочетании с гель-проникающей хроматографии размер становится все более распространенным которая обеспечивает дополнительный контроль качества шаг. Недавно там был сильный прогресс в сочетании, ЯМР и лучей данных с использованием метода оптимизации ансамбль (МНВ)45,46 для выяснения гибких систем. В недавнем документе Мертенс и Свергун47авторы описывают несколько недавних примеров МНВ лучей в сочетании с ЯМР, вместе с много других примеров лучей данных, используемых в сочетании с ЯМР. Постоянно успехи в настоящее время в области лучей, и новые методы в настоящее время разработан для лучей, которые будут использоваться в сочетании с, не только дополнять, другие структурные методы. Следовательно мы считаем, что спрос на лучей будет только возрастать с течением времени, особенно в сочетании с ЯМР для характеристики динамических систем, где функции определяются гибкость.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был поддержан Сенти-RGPIN-2018-04994, кампус Альберта инновационной программы (RCP-12-002 C) и Альберта прионных научно-исследовательский институт / Альберта инновационную био решения (201600018) гранты для м.о. TRP это Канада исследований кафедры в РНК & Биофизика белка (201704) и признает Сенти обнаружения Грант (RGPIN-2017-04003). TM финансируется грантом Сенти обнаружения для ТРП

Materials

HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability – Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare – FPLC System
Nanodrop Nanodrop – Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku – SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd – Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku – Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 – SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 – Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 – Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 – Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 – Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 – Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 – Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd – DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. – The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 – PDB ID: 1NPE
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions?. Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. 생화학. 38 (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -. P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, n. u. l. l., Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -. H., Wang, J. -. H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).

Tags

Small Angle X-ray ScatteringSAXSStructural StudiesMacromoleculesBiomoleculesBiophysical MethodsStructural BiologyStructure-based TherapeuticsNanoparticlesDrug DeliveryData AnalysisATSAS Software SuiteGuinier AnalysisRadius Of Gyration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image