العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس
Summary
هنا نقدم طريقة لعزل الغدد الكظرية من الفئران، وإصلاح الأنسجة، وقسم منهم، وأداء تلطيخ الفلورة.
Abstract
تقنية راسخة للكشف عن المستضدات في الأنسجة مع عمل الأجسام المضادة مترافق fluorochrome الفلورة ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات. الكشف عن المستضدات يسمح لتوصيف وتحديد العديد من أنواع الخلايا. تقع فوق الكليتين ومغلفة بطبقة من الخلايا الوسيطة، الغدة الكظرية جهاز الغدد الصماء تتألف من اثنين من أنسجة مختلفة مع مختلف الأصول الجنينية وميسونيفريك المتوسطة mesoderm-مشتقة الخارجي قشرة العصبية لب الداخلية المستمدة من كريست. تفرز قشرة الغدة الكظرية المنشطات (أي، مينيرالوكورتيكويدس، والكورتيزون، الهرمونات الجنسية)، في حين الكظر تنتج الكاتيشولامين (أي، الأدرينالين، نورادرينالين). أثناء إجراء البحوث الغدة الكظرية، من المهم أن تكون قادرة على التمييز بين خلايا فريدة من نوعها مع وظائف مختلفة. هنا نقدم بروتوكول وضعت في المختبر الذي يصف سلسلة من الخطوات المتسلسلة المطلوبة للحصول على تلطيخ الفلورة لوصف أنواع خلايا الغدة الكظرية. ونحن نركز أولاً على تشريح الغدد الكظرية الماوس، إزالة الدهون بيريادرينال متبوعاً بالتثبيت، وتجهيز وتضمين البارافين الأنسجة المجهرية. ثم يصف لنا تقطيع كتل الأنسجة مع مبضع دوارة. وأخيراً، نحن تفاصيل بروتوكول لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت الغدد الكظرية التي قمنا بتطوير لتقليل جسم غير محددة ملزمة وأوتوفلوريسسينسي من أجل تحقيق إشارة أمثل.
Introduction
إيمونوهيستوتشيميستري أسلوب للكشف عن مكونات النسيج باستخدام أجسام مضادة محددة من الجزيئات الخلوية وتقنيات المصبوغة اللاحقة للكشف عن الأجسام المضادة مترافق1. يتطلب هذا الإجراء المناعي التثبيت المحددة وتجهيز الأنسجة التي تتحدد غالباً تجريبيا مستضد معين، استخدام أنسجة وجسم2. تثبيت أمر حاسم للحفاظ على حالة الأنسجة وبالتالي الحفاظ على هياكل سوبسيلولار والخلوية سليمة وأنماط التعبير “الأصلي”. كذلك تجهيز وتضمين إجراءات مطلوبة لإعداد الأنسجة لتمزيقها إلى شرائح رقيقة التي يتم استخدامها لدراسات نسيجية التي تنطوي على إيمونوهيستوتشيميستري.
يمكن إجراء إيمونوستاينينج مع الكشف اللونية أو الفلورسنت. كشف اللونية يتطلب استخدام إنزيم تحويل ركيزة القابلة لذوبان إلى منتج ملونة غير قابلة للذوبان. بينما يمكن مترافق هذا الإنزيم إلى جسم إذ تسلم المستضد (جسم الأولية)، هو أكثر في كثير من الأحيان مترافق بجسم الاعتراف بجسم الأولية (أي، جسم الثانوي). هذا الأسلوب حساسة للغاية؛ المنتج الملونة الناتجة عن رد فعل الانزيمية فوتوستابل ويتطلب إلا مجهر برايتفيلد للتصوير. ومع ذلك، إيمونوستينينج اللونية قد لا تكون مناسبة عندما تحاول أن تصور البروتينات هما ترجمة المشترك، نظراً للترسب لون واحد يمكن أن تخفي ترسب واحدة أخرى. في حالة الاشتراك تلطيخ، أثبت الفلورة لتكون أكثر فائدة. ويعزى ظهور الفلورة “ألبرت كونس” وزملائه، الذين وضعت نظاما لتحديد المستضدات الأنسجة مع الأجسام المضادة التي تحمل فلوريسسين وتصور لهم في الأنسجة مقطعة تحت الضوء فوق البنفسجي3. وتستند الأسفار الكشف عن جسم مترافق مع فلوروفوري التي تنبعث الضوء بعد الإثارة. لأن هناك عدة فلوروفوريس مع الانبعاثات عند أطوال موجية مختلفة (مع تداخل قليلاً أو لا)، طريقة الكشف عن هذا المثل الأعلى للدراسات الخاصة بالبروتينات متعددة.
الغدة الكظرية جهاز المزدوجة الموجودة فوق الكلي، وتتميز بعنصرين متميزين امبريولوجيكالي محاطة بكبسولة الوسيطة. قشرة الغدة الكظرية الخارجي، المستمدة من ميسوديرم المتوسطة ميسونيفريك، تفرز هرمونات الستيرويد بينما تنتج لب الداخلية، المستمدة من قمة العصبية، الكاتيشولامين بما فيها الأدرينالين ونورادرينالين والدوبامين. قشرة الغدة الكظرية ينقسم الأشيع ووظيفيا في ثلاث مناطق متحدة المركز، مع كل منطقة إفراز فئات مختلفة من هرمونات الستيرويد: الخارجي zona glomerulosa (زج) تنتج مينيرالوكورتيكويدس التي تنظم التوازن المنحل بالكهرباء و حجم داخل الأوعية؛ فاسسيكولاتا زونا الأوسط (zF)، مباشرة تحت زج، تفرز الكورتيزون التي تتوسط استجابة الإجهاد من خلال تعبئة مخازن الطاقة لزيادة جلوكوز البلازما؛ وقد زونا الداخلية (zR)، الذي يجمع الجنس السلائف الستيرويد (أي، وديهيدرو (داس))4.
يوجد بعض الاختلاف في تقسيم البطاني بين الأنواع: فعلى سبيل المثال، يفتقر موس موسكولوس zR. العاشر بعد الولادة الفريدة-منطقة موسكولوس م. من بقايا من قشرة الجنين تتميز بالخلايا الدهنية-الفقراء الصغيرة مع سيتوبلاسمس acidophilic5. س-المنطقة يختفي في سن البلوغ في الفئران الذكور وبعد الحمل الأول في الفئران الإناث، أو يتدهور تدريجيا في الإناث التي ولدت عدم6،7. وعلاوة على ذلك، تورتوسيتي وسمك المعروضات زج علامة التباين بين الأنواع كما يفعل منظمة للخلايا الجذعية والسلف المحيطية في وزج المناطق المجاورة لها. الفئران، خلافا لسائر القوارض، لدى منطقة غير متمايزة مرئية (زو) بين زج و zF التي تعمل كمنطقة خلايا الجذعية و/أو منطقة عابرة تضخيم موروث. ما إذا كان زو فريدة من نوعها للفئران أو ببساطة أكثر بارزة نظمت مجموعة من الخلايا هو غير معروف8،9.
تحتوي الخلايا للقشرة الكظرية قطرات الدهن التي تخزن استرات الكوليسترول التي تكون بمثابة مقدمة لجميع هرمونات الستيرويد10،11. ويعرف مصطلح “ستيرويدوجينيسيس” عملية إنتاج هرمونات الستيرويد من نسبة الكولسترول في الدم عن طريق سلسلة من التفاعلات الانزيمية التي تنطوي على نشاط عامل ستيرويدوجينيك 1 (SF1)، التعبير الذي علامة على إمكانات ستيرويدوجينيك. في الغدة الكظرية، التعبير Sf1 موجودة فقط في خلايا اللحاء12. دراسة مثيرة لاهتمام وجدت التعبير عن البيوتين الذاتية في الخلايا البطاني مع احتمال ستيرويدوجينيك13. بينما يمكن أن يكون هذا سبب خلفية أعلى في أساليب المصبوغة البيوتين/المستندة إلى ستريبتافيدين، بسبب الكشف عن البيوتين الذاتية بجسم مترافق مع streptavidin، وهذه الخاصية يمكن استخدامها أيضا للتمييز في ستيرويدوجينيك خلايا من السكان الآخرين داخل الغدة الكظرية، أي، بطانية، والحافظة، وخلايا لب.
معصب من يتعاطف مع الخلايا العصبية بريجانجليونيك، الكظر تتسم بالخلايا باسوفيليك مع السيتوبلاسما حبيبية تتضمن أدرينالين وإفراز. خلايا لب تسمى “تشرومافين” بسبب ارتفاع محتوى الكاتيشولامين التي تشكل صبغة بني بعد أكسدة14. Hydroxylase التيروزين (TH) هو الإنزيم الذي يحفز الخطوة الحد من معدل في تركيب الكاتيشولامين، وفي الغدة الكظرية، وهو أعرب عن فقط في لب15.
نقدم هنا بروتوكولا لعزل الماوس الغدد الكظرية، تجهيزها للتضمين في البارافين وتمزيقها وأسلوب أداء الفلورة تلطيخ في الفروع الكظرية بغية التعرف على أنواع الخلايا التي تشكل قشرة الغدة الكظرية ولب. هذا البروتوكول معيار في المختبر إيمونوستينينج مع الأجسام المضادة متعددة تستخدم بشكل روتيني في بحوثنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الغدد الكظرية الماوس جنبا إلى جنب مع الإعداد وتلطيخ للغدة الكظرية مقطعة الماوس جزءا لا يتجزأ من البارافين.
بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى نحن اختبار، أثبت هذا البروتوكول الفلورة مناسبة لمعظم الأجسام المضادة المستخدمة في المختبر. ومع ذلك، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور محمد الزبير على اقتراحاته المفيدة والمساعدة التقنية في وضع هذا البروتوكول. كان يدعمها هذا العمل في المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي، “معاهد الصحة الوطنية لمنحه بحثية” 2R01-DK062027 (إلى G.D.H).
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
