Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Imuno-histoquímica é uma técnica para a detecção de componentes de tecido com o uso de anticorpos contra moléculas celulares específicas e técnicas de coloração subsequentes para detectar os anticorpos conjugados¹. Este procedimento de imuno-histoquímica requer fixação específica e processamento de tecidos que são frequentemente empiricamente determinados para o antígeno específico, tecido e anticorpo utilizaram². A fixação é crucial para preservar o estado “original” de tecido e, mantendo intacta celular e subcellular estruturas e padrões de expressão. Mais processamento e incorporação de procedimentos são necessários para preparar o tecido para corte em fatias finas que são usadas para estudos histológicos, envolvendo a imuno-histoquímica.

Immunostaining pode ser executada com deteção fluorescente ou cromogênica. A detecção cromogênica exige a utilização de uma enzima para converter um substrato solúvel em um produto colorido insolúvel. Enquanto esta enzima pode ser conjugada com o anticorpo reconhecer o antígeno (anticorpo primário), é mais frequentemente conjugado ao anticorpo reconhecendo o anticorpo primário (ou seja, o anticorpo secundário). Esta técnica é altamente sensível; o produto colorido resultante da reação enzimática é fotoestável e requer apenas um microscópio brightfield para a imagem latente. No entanto, cromogênico immunostaining pode não ser adequado ao tentar visualizar duas proteínas que co localizar, uma vez que a deposição de uma cor pode mascarar a deposição do outro. No caso de co coloração, imunofluorescência tem provado para ser mais vantajoso. O advento da imunofluorescência é atribuído a Albert Coons e colegas, que desenvolveram um sistema para identificar o tecido antígenos com anticorpos marcados com fluoresceína e visualizá-las nos tecidos sob luz ultravioleta³seccionados. Detecção de fluorescência é baseado em um anticorpo conjugado com um fluoróforo que emite luz após a excitação. Porque existem vários fluorophores com emissões em diferentes comprimentos de onda (com pouca ou nenhuma sobreposição), esse método de deteção é ideal para os estudos de várias proteínas.

A glândula adrenal é um órgão emparelhado localizada acima do rim e caracterizado por dois componentes distintos embryologically rodeadas por uma cápsula mesenquimal. O córtex adrenal exterior, derivado da mesoderma intermediária mesonéfricos, segrega hormonas esteroides, enquanto a medula interna, derivada da crista neural, produz catecolaminas, incluindo adrenalina, noradrenalina e dopamina. O córtex adrenal é histologicamente e funcionalmente dividido em três zonas concêntricas, com cada zona secretoras de classes diferentes de hormônios esteroides: o exterior zona glomerulosa (zG) produz mineralocorticoides que regulam a homeostase do eletrólito e volume intravascular; a médio zona fasciculada (zF), diretamente abaixo do zG, segrega glicocorticoides que medeiam a resposta ao estresse através da mobilização das lojas da energia para aumentar a glicose do plasma; e o interior zona reticular (zR), que sintetiza sexo precursores esteroides (ou seja, Dehidroepiandrosterona (DHEAS))⁴.

Alguma variação no zoneamento adrenocortical está presente entre as espécies: por exemplo, Mus musculus carece da zR. A única zona X pós-natal de M. musculus é um remanescente do córtex fetal, caracterizado por pequenas células de lipídios-pobres com acidofílicas cytoplasms⁵. A X-zone desaparece na puberdade em ratos do sexo masculinos e após a primeira gravidez em ratos fêmeas, ou gradualmente degenera em fêmeas de raça não^6,7. Além disso, a tortuosidade e a espessura das exposições zG marcada variação entre espécies como organização de células tronco e progenitoras periféricas em e adjacente para o zG. O rato, ao contrário de outros roedores, tem uma zona de indiferenciadas visível (zU) entre o zG e zF que funciona como uma zona de células-tronco e/ou uma zona de transiente amplificando progenitores. Se o zU é exclusivo para ratos, ou simplesmente uma forma mais organizada com destaque aglomerado de células é desconhecido^8,9.

Células do córtex adrenal contêm gotículas lipídicas que armazenam os ésteres de colesterol que servem como o precursor de todos os hormônios esteroides^10,11.  O termo “esteroidogênese” define o processo de produção de hormônios esteroides de colesterol através de uma série de reações enzimáticas que envolvem a atividade esteroidogênica fator 1 (SF1), cuja expressão é um marcador de potencial esteroidogênica. Na glândula adrenal, Sf1 expressão está presente apenas em células do córtex¹². Um interessante estudo encontrou a expressão de biotina endógena adrenocortical células com potencial esteroidogênica¹³. Enquanto esta pode ser a causa da maior experiência em biotina/estreptavidina-com base em métodos de coloração, devido a detecção de biotina endógena pelo anticorpo conjugado com estreptavidina, esta característica pode ser também empregada para distinguir o esteroidogênica células de outras populações dentro da glândula adrenal, ou seja, endoteliais, capsular e células da medula.

Inervados pelo simpáticos neurônios preganglionic, a medula adrenal é caracterizada por basophilic células com uma citoplasma granular contendo epinefrina e norepinefrina. Células da medula são denominadas “cromafim” devido ao alto teor de catecolaminas que formam um pigmento marrom após oxidação¹⁴. Tirosina Hidroxilase (TH) é a enzima que catalisa a etapa limitante na síntese de catecolaminas e, na glândula adrenal, é expressa apenas na medula¹⁵.

Aqui nós apresentamos um protocolo para a isolação do rato as glândulas supra-renais, seu processamento para incorporação em parafina e corte e um método para realizar a mancha na adrenais seções a fim de identificar os tipos celulares que constituem o córtex adrenal e medula. Este protocolo é um padrão em nosso laboratório de imunocoloração com múltiplos anticorpos usados rotineiramente em nossa pesquisa.