Her beskriver vi en protokol for immunisering af de voksne zebrafisk (Danio rerio) med en DNA-baseret vaccine og demonstrere validering af en vellykket vaccination begivenhed. Denne metode er velegnet til præklinisk screening af vaccine kandidater i forskellige infektion modeller.
Interessen for DNA-baserede vaccination er steget i løbet af de seneste to årtier. DNA vaccination er baseret på kloning af en sekvens af en valgte antigen eller en kombination af antigener i et plasmid, som gør det muligt for en skræddersyet og sikker design. Administration af DNA-vacciner i værtsceller fører til ekspression af antigener, der stimulerer både humorale og celle-medieret immunrespons. Denne rapport beskriver en protokol for kloning af antigen sekvenser i pCMV-EGFP plasmid, voksen zebrafisk vaccination med vaccine kandidaterne ved intramuskulær mikroinjektion, og den efterfølgende elektroporation at forbedre indtagelsen. Vaccineantigener er udtrykt som grøn fluorescerende proteiner (NGL)-fusion proteiner, som giver mulighed for bekræftelse af antigen udtryk under UV-lys fra levende fisk og kvantificering af udtryk niveauer af fusion protein med ELISA, såvel som deres registrering med en western blot analyse. Den beskyttende effekt af vaccinen kandidater er testet ved at inficere fisk med Mycobacterium marinum fem uger postvaccination, efterfulgt af kvantificeringen af bakterier med qPCR fire uger senere. I forhold til pattedyr præklinisk screening modeller, giver denne metode en omkostningseffektiv metode til den indledende screening af nye DNA-baserede vaccine kandidater mod en mykobakterielle infektioner. Metoden kan anvendes yderligere til screening DNA-baserede vacciner mod forskellige bakterielle og virale sygdomme.
De første DNA-vaccine undersøgelser blev udført i 1990s1, og siden da, er blevet testet DNA vacciner mod forskellige smitsomme sygdomme, kræft, autoimmunitet og allergi2. I pattedyr, en DNA-vaccine mod West Nile virus hos heste og en terapeutisk kræft vaccine for canine mundtlig melanom er blevet licenseret, men disse er ikke i øjeblikket i klinisk brug2. Ud over den interesse, der er fremkaldt af pattedyr undersøgelser, har DNA vaccination viste sig for at være en praktisk måde at immunisere opdrættede fisk mod virussygdomme. En vaccine mod fisk infektiøs hæmatopoietisk nekrose virus (IHNV) har været i kommerciel brug siden 2005, og en vaccine mod infektiøs pankreasnekrose virus (IPNV) blev for nylig godkendt3. Derudover udvikles flere DNA-vacciner mod fisk patogener.
Som traditionelle vacciner indeholder ofte inaktiveret eller levende svækkede patogener, udgør de en potentiel risiko for overførsel af sygdommen2. DNA vacciner, til gengæld hindre denne risiko, som de er baseret på forvaltningen af plasmid kodning bakteriel eller viral antigener, snarere end hele patogenet, selv2,4. DNA vacciner er produceret med DNA rekombination teknikker, som giver mulighed for den præcise udformning af vaccineantigener og fleksibel formulering af antigen kombinationer og adjuvanter i en enkelt vaccine konstruere5. Derudover er produktion af DNA vacciner hurtigere, lettere og mere omkostningseffektiv end protein-baserede rekombinante vacciner, som er en stor fordel for vaccine kandidat screening formål, men også, for eksempel, i tilfælde af pandemisk udbrud 2.
I fisk, de mest almindelige administrationsveje for DNA-vacciner er intraperitoneal, intramuskulær og mundtlige3,6,7, mens i pattedyr, subkutane og intradermal ruter er yderligere indstillinger2. Efter en intramuskulær injektion, administrated DNA plasmider angive celler på administrationswebstedet (fx., for det meste myocytes, men også bosat antigen-præsenterer celler [PMV’er]). Andelen af transfekteret celler kan forøges betydeligt ved elektroporation2,8. Efter indtastning af cellen, træder nogle plasmid DNA atomkernen, hvor gener kodet af plasmidet er transskriberede2. I denne protokol benytter vi den pCMV-EGFP plasmid, der har en stærk allestedsnærværende promotor optimeret til eukaryote udtryk9. I denne konstruktion oversættes antigener som en fusion protein med en normal god landbrugspraksis. Normal god landbrugspraksis muliggør bekræftelse af en vellykket vaccination og den korrekte antigen vare af den simple visualisering af antigen udtryk med et fluorescens mikroskop i levende fisk.
I pattedyr, har DNA vacciner vist sig at stimulere forskellige typer af immunrespons afhængigt af transfekteret celle typer2,5. Transfekteret myocytes udskiller antigener i det ekstracellulære rum eller frigive dem ved celledød, og antigener opslugt af PMV’er er, efterfølgende, præsenteret på store histocompatibility komplekse II molekyler2. Dette udløser CD4 og CD8 T celle svar, især ud over B-celle svar2,5,10. I fisk, er T og B lymfocytter samt dendritiske celler (DCs), blevet identificeret, men deres arbejdsdeling i antigen præsentation er mindre godt forstået11. Zebrafisk DCs, dog har vist sig at dele bevarede fænotypiske og funktionelle egenskaber med deres pattedyr modparter12. Derudover har DNA vaccination vist sig at fremkalde lignende immunrespons i fisk og pattedyr, herunder T og B-celle svar6,13,14,15,16 .
Både larver og voksne zebrafisk er almindeligt anvendt til model forskellige smitsomme sygdomme, såsom fisk M. marinum infektion model af tuberkulose i denne protokol17,18,19,20 ,21,22. I forhold til pattedyr modelorganismer, fordelene ved zebrafisk omfatter deres lille størrelse, hurtig reproducerbarhed, og lave boliger udgifter23. Disse aspekter gør zebrafisk en ideel dyremodel for omfattende præklinisk screening undersøgelser for innovative vacciner og lægemiddelsammensætninger23,24,25.
I denne protokol beskrive vi, hvordan romanen vaccineantigen kandidater mod mycobacteriosis kan vurderes af DNA-baserede vaccination af voksen zebrafisk. Først beskriver vi, hvordan antigener er klonet i pCMV-EGFP udtryk plasmid, efterfulgt af en detaljeret protokol til intramuskulær injektion af vaccine plasmider og den efterfølgende elektroporation i musklen. Udtryk for hver antigen er bekræftet af Fluorescens mikroskopi uges postimmunization. Effekten af antigen kandidater er derefter testet af eksperimentelt inficerer vaccinerede fisk med M. marinum.
Proceduren for immuniserende voksen zebrafisk med DNA-baserede vacciner kræver nogle tekniske ekspertise. Selv for en erfaren forsker tager vaccinating en enkelt fisk ca 3 min, bortset fra præparater. Således kan et maksimum på omkring 100 fisk være vaccineret inden for en dag. Hvis mere end 100 fisk er nødvendige for eksperimentet, kan immuniseringer opdeles mellem op til 3 dage. Ud over kvaliteten af eksperimentet er tilstrækkelige uddannelsen af forsker for håndtering af fisk og udfører vaccination afgørende for trivsel af fisk. Sørg for at følge lokale juridiske og dyrevelfærdsmæssige regler og retningslinjer, når det kommer til bolig fisk, planlægger eksperimenterne, og de kvalifikationer, der kræves for det personale, der udfører forsøgene.
I sammendrag er der flere vigtige skridt til at undgå komplikationer i vaccination protokollen. For den vellykkede vaccination, sikrer at 1) fisk at blive immuniseret er sunde og tilstrækkelige i alder og størrelse (immunisering af mere ungfisk kan kræve ned-skalering vaccine volumen og indstillingerne for elektroporation); 2) fisk er korrekt bedøvede uden stærkere end 0,02% 3-aminobenzoic syre ethylester, og de forbliver bedøvede under hele proceduren (anæstesi skal holdes så kort som muligt for at sikre inddrivelse af fisken); 3) svampen pad er korrekt gennemblødt; 4) væske sprøjtes i hver puls fra pneumatisk pumpen, og hvis ikke, puls længden reguleres (trækker nålen lidt bagud langs y-aksen kan hjælpe); 5) der er ingen luftbobler med vaccine løsning; 6) elektroporation indstillinger og faktiske puls spænding og længden er korrekt; 7) elektroderne ikke forårsager hudskader på webstedet elektroporation (under elektroporation, holde elektroderne i blid kontakt med fisk, og frigive fisk straks ind i recovery tanken efter elektroporation).
Det er vigtigt at overvåge fisken efter elektroporation i recovery tank og aflive en fisk, der udviser tegn på ubehag. Derudover er det nødvendigt at øve proceduren før du starter en storstilet eksperiment, for at sikre en flydende arbejdsgang. Hvis det er muligt, anmode en tilstrækkeligt uddannede kollega om bistand med påfyldning nåle og elektroporation.
DNA vaccination metode gør det muligt for de skræddersyede design af vaccineantigener. Det er muligt at klone den hele antigen eller, helst, vælge dele af antigenet baseret på cellulære lokalisering og immunogenicitet24. Metoden kan desuden kombinere flere antigener eller adjuvanter i en vaccine konstruere eller indsprøjte flere separate plasmider på samme tid2. Ved herunder en stop codon efter antigen sekvens eller udtagelse EGFP genet fra plasmidet, er det muligt at udnytte den samme plasmid vektor også at udtrykke antigen uden efterfølgende N-terminale normal god landbrugspraksis. Dette kan rimelighed i bekræfter positive screening resultaterne, som de relativt store størrelse af normal god landbrugspraksis kan påvirke foldning af antigenet og således begrænse humorale svar potentielt fremkaldt af vaccination.
En højere antigen udtryk har været knyttet til DNA-vaccine immunogenicitet2. Elektroporation efter injektion, således medtaget i denne protokol, som det har vist sig at øge udtryk af antigener eller reporter gener fra firedoblet til tifold i zebrafisk32. Derudover forårsager elektroporation som en teknik, der moderat vævsskade, således inducerende lokale betændelse, der yderligere fremmer vaccine-induceret immunrespons2. På den anden side er elektroporation generelt veltolereret. Med det udstyr, der anvendes her, vil næsten 100% af voksne zebrafisk komme godt fra seks pulser af 40 V brugt i denne protokol35.
Ud over at bruge elektroporation til at forbedre optagelsen af vaccine plasmid ind i cellerne, bruger vi en stærk allestedsnærværende promotor i vaccine plasmid og en polyA hale i 3′-slutningen af antigenet for at forbedre antigen udtryk i transfekteret fisk celler. I nogle tilfælde, hvis codon skik sygdomsbærer mål væsentligt afviger fra de vaccinerede arter, er codon optimering blevet fundet nyttige i yderligere øge målet gen expression2. I denne zebrafisk –M. marinum model, men codon optimering havde ingen signifikant effekt på udtryk niveauer af to mykobakterielle model gener, ESAT-6 og den fælles fiskeripolitik-10, og dermed har, blevet anset for unødvendigt i denne model35 .
Target gen expression profiler har nogle tidsmæssige variation mellem antigener, afhængigt af, for eksempel på størrelse og struktur af de pågældende antigener. Antigen udtryk er dog normalt lignende inden for en gruppe af fisk immuniseret med den samme vaccine. Typisk, den klogeste EGFP udtryk er observeret fire dage til en uge postvaccination, men en skala fra 2-10 dage er muligt. Det anbefales at validere udtryk for hver antigen-EGFP fusion protein i en lille gruppe af fisk (2 – 3) før herunder antigenet i et omfattende eksperiment. Hvis ingen normal god landbrugspraksis udtryk er observeret på ethvert punkt 2 – 10 dage efter immunisering, Sørg for, at 1) vaccination protokollen blev nøje fulgt. Altid har en gruppe af fisk immuniseret med tomme pCMV-EGFP plasmid som positiv kontrol og sørge for, at 2) antigen design og molekylær kloning blev udført korrekt (passende primer design; antigenet og EGFP tag er begge i samme læsning ramme og ingen mellemliggende stop kodon er inkluderet). I nogle tilfælde, på trods af den korrekte antigen design, ikke kan normal god landbrugspraksis påvises. Dette kan skyldes forkert folde eller hurtig fordeling af fusion protein. Under disse omstændigheder kan det være nødvendigt at redesigne antigenet.
I vacciner, der er brugt til immun opdrættede fisk, er den plasmid dosis anvendes typisk 1 µg eller mindre7,33,34. I zebrafisk, kan reporter gen expression også påvises efter mindst en 0,5 µg plasmid injektion efter elektroporation; relative mål genekspression øger dog med en større mængde af plasmidet pr. fisk (tillægs figur 1). I fisk sprøjtes med pCMV-EGFP reporter plasmid, førte en indsprøjtning med 5 – 20 µg af plasmid fire til otte gange højere EGFP niveauer i forhold til fisk injiceres med 0,5 µg. Derfor, for at sikre et højt nok mål genekspression, men har injektionsvolumener, der er lille nok (≤7 µL) at forebygge eventuelle overskydende vævsskader eller vaccine lækage, valgte vi at anvende 5 til 12 µg pr. fisk til de indledende screening. Ud over vaccine immunogenicitet, en høj nok mål genekspression er forpligtet til at registrere reporter gen expression med et fluorescens mikroskop og med vestlige skamplet, som er nødvendige til screening at bekræfte den korrekte i vivo Oversættelse af target-antigen. Dog lavere plasmid doser (0,5-1 µg) kan være nyttige for andre typer af eksperimentelle anvendelser.
Til sidst, kan denne protokol for immunisering af voksen zebrafisk med en DNA plasmid bruges til præklinisk afprøvning af nye vaccine kandidater mod forskellige bakteriel eller viral infektioner. Udtryk for vaccineantigen som en normal god landbrugspraksis-fusion protein giver mulighed for visualisering af en vellykket immunisering begivenhed og antigen udtryk. Vi anvender denne metode til præklinisk screening af nye vaccine antigen kandidater mod tuberkulose. For dette, vi inficere zebrafisk fem uger postvaccination og bestemme bakterielle tæller i hver fisk med qPCR20,24.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for medlemmer af gruppen eksperimentelle immunologi forskning, og især at Leena Mäkinen og Hannaleena Piippo, for alt arbejdet, de har gjort med at udvikle og optimere vaccination protokollen, og deres hjælp i egentlige eksperimenter ved hjælp af protokollen.
Dette arbejde blev støttet af Jane Jensen Aatos Erkon Säätiö (Jane og Aatos Erkko-fonden til M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Foundation; at M.R.), den konkurrencedygtige statslige forskning finansiering af området ekspert ansvar i Tampere Universitet Hospital (til M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tuberkulose Foundation; at M.R., H.M. og M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (finsk kulturfond; at H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finsk Anti-tuberkulose Foundation; til H.M.), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö og Laina Kivi-fonden til M.N.) og Tampere by Science Foundation (til M.N.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |