이 프로토콜 Zika 바이러스 탐지 또는 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)에 의해 대상 인간의 소변 및 혈 청 샘플 또는 모기를 제어 하는 효율적이 고 저렴 한 비용 메서드를 제공 합니다. 이 메서드는 RNA 격리는 필요 하지 않습니다 하 고 30 분 이내 할 수 있습니다.
그러나 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 성인 무 증상 일 수 있다,, 임신 중 감염 유산 및 심각한 신경 기형이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 신속 하 게 모두 인간과 모기 샘플에서 ZIKV를 검색 하는 것입니다. ZIKV 검출에 대 한 현재 금 표준 이다 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR); 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)은 보다 효율적이 고 저렴 한 비용 테스트 고가의 장비에 대 한 필요 없이 수 있습니다. 본이 연구에서는 실시간 램프 첫 샘플에서 RNA를 분리 하지 않고 ZIKV 검출 다양 한 생물 학적 샘플 30 분 이내에 사용 됩니다. 이 기술은 ZIKV를 사용 하 여 환자 소변 및 혈 청, 감염 및 감염 모기 샘플 시연입니다. 18S ribosomal ribonucleic 산과 말라 각각 인간과 모기 샘플에서 컨트롤로 사용 됩니다.
2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV) 주목 저명한 글로벌 관심사의 전염 성 질환으로 임신 중에 감염 유산, 사 산, microcephaly, 뿐만 아니라 다른 선 천 성 신경 심각한 출생 결함에 연결 했다 때문에 출생 결함1. 드문 경우에, ZIKV Guillain-바레 증후군과 연결 되었습니다. ZIKV는 주로 Aedes 모기;로 전송 그러나, 그것은 또한 성적 접촉1통해 확산 하실 수 있습니다. ZIKV 감염 대부분의 사람에서 무 증상 또는 다른 arborviruses1의 감염의 증상과 겹치는 가벼운 감기 같은 증상으로 선물 한다, 그의 신속 하 고 비용 효율적인 검색을 위한 향상 된 방법 필요가 했다 사람 뿐만 아니라 현지 모기 인구를 화면에 ZIKV.
양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR)은 ZIKV 감지;에 대 한 신뢰성 분석 결과 그러나,이 기술은 고가의 특수 장비, 숙련 된 직원, 그리고 관심의 샘플에서 RNA 격리 해야합니다. 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)는만 가닥으로 thermophilic DNA 중 합 효소의 사용으로 인 한 부 화 온도 필요로 하는 PCR 기술에 따라 1 단계 핵 산 증폭 방법 변위 속성입니다. 이 thermocycler 니드 circumvents 고 분석 결과 완료 하는 데 필요한 시간을 줄입니다. RT-램프의 추가 장점 높은 특이성, 감도, 견고성 pH 수준 및 온도, 저항 많은 PCR 억제제2의 범위에 포함 됩니다. 그것은 상대적으로 저렴 한 비용 및 시 약은 실 온에서 안정. 이러한 특성을 감안할 때, RT-램프 배포할 수 있습니다 실험실에서 또는 분야에서. 등, 램프 반응 병원 체와 감염3,,45의 다른 종류의 범위를 검출 하기 위하여 개발 되었습니다. 이 문서에 설명 된 RT 램프 프로토콜의 목표는 인간의 혈 청 및 소변 샘플에도 RT 램프를 통해 30 분 이내 단일 감염 된 모기에서 RNA 격리 없이 ZIKV를 감지. 그것은 실험실 밖으로 신속 하 고 설정에서 작동 민감한, 신속한 진단 도구 qRT-PCR을 대체 하이 메서드를 사용할 수 있습니다.
ZIKV RT-램프 분석 결과 인간과 모기 샘플6을 사용 하 여이 종이 작품에 설명 된. 탐지의 한계는 약 1 게놈에 해당6, 증상 ZIKV 감염 환자의 일반적인 바이러스 부하 이기 때문에 10 충분 해야3 106 PFU/mL7. 또한,이 방법은 ZIKV 샘플 먼저 분리 RNA와 세포 배양에서 바이러스 증폭 없이 검색할 수 있습니다. 이 크게 시간, 비용, 및 …
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 모 린과 로널드 허쉬 가족 자선 기여 및 필드 신경 과학 연구소, 세인트 메리의 미시간의 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. 우리 또한 그들의 중요 한 검토의 원고에 대 한 박사 집 엔 Zwaans와 엘리야 드를 감사합니다.
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
100mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
100mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |