الإنزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والأنزيمات
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لشركة إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الأنزيمي في حبة للدراسة في نفس الوقت مساهمة مجالات محددة من البروتين مستقبلات غشاء البلازما لأنزيم التوظيف ونشاط إنزيم.
Abstract
هي الإنزيمات المرتبطة بمستقبلات الوسطاء الرئيسية لتنشيط الهاتف الخلوي. هذه الإنزيمات وينظم، على الأقل في جزء منه، التفاعلات المادية مع ذيول هيولى مستقبلات. التفاعلات وكثيراً ما تحدث من خلال مجالات محددة من البروتين ويؤدي إلى تنشيط الإنزيمات. هناك عدة طرق لدراسة التفاعلات بين البروتينات. بينما co-إيمونوبريسيبيتيشن يستخدم عادة لدراسة المجالات التي تكون مطلوبة لتفاعلات البروتين البروتين، هناك لا فحوصات تلك الوثيقة مساهمة مجالات محددة لنشاط الإنزيمات المعينين في نفس الوقت. تبعاً لذلك، يجمع بين الأسلوب الموصوفة هنا co-إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الأنزيمي في حبة للتقييم المتزامن للتفاعلات بين البروتينات والتنشيط الانزيمية المرتبطة بها. والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد المجالات التي تعتبر بالغة الأهمية للتفاعلات الفيزيائية بين بروتين والانزيم والمجالات التي إلزامية للتنشيط الكامل للانزيم. وتتضح أهمية هذا الفحص، كبعض مستقبلات نطاقات البروتين تسهم الملزمة للانزيم بذيل هيولى المستقبلات، مع مجالات أخرى ضرورية لتنظيم وظيفة إنزيم نفس.
Introduction
مستقبلات الحفاز ومستقبلات تيروسين مؤنزم هي بروتينات transmembrane فيها أسباب ملزمة ليجند خارج الخلية النشاط الأنزيمي على الجانب داخل الخلية1. تمتلك بعض مستقبلات مستقبلات ووظائف الانزيمية، بينما آخرون توظيف إنزيمات معينة مثل مؤنزم وفوسفاتاسيس إلى ذيولها هيولى. التجنيد لأنزيم الذيل المستقبلات وعمل الحفاز اللاحقة لهذا الإنزيم هي عمليتين منفصلتين لا تخضع دائماً لنطاقات البروتين نفسه2. لسوء الحظ، هناك أية أدوات محددة لتقييم كل من التفاعل والنشاط الأنزيمي في وقت واحد. الإنزيم co-إيمونوبريسيبيتيشن الفنية الموصوفة هنا طريقة مفيدة لتشريح توظيف إنزيم بذيل مستقبلات من تنشيطه. ويستخدم هذا التحليل إيمونوبريسيبيتيشن مستقبلات الموسومة بالخرز المغلفة بالأجسام المضادة. في وقت لاحق، يتم تنفيذ كلا من تحليل النشاط الأنزيمي وتحليل لطخة غربية في الخرز. والهدف العام لهذا الأسلوب للكشف عن المجالات البروتينات التي هي ضرورية للتفاعلات بين المستقبلات والأنزيمات بتحليل لطخة غربية (تقييم) والمجالات التي هي إلزامية للتنشيط الكامل للإنزيمات (تقاس على حبة تحليل النشاط الأنزيمي). أنها هامة لتطوير أدوات لدراسة مهام منفصلة مرتبطة بمستقبلات الإنزيمات بسبب مشاركتهم في الآلية المرضية للأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد تساعد المزيد من فهم آليات العمل هذه البروتينات تصميم التدخلات العلاجية الرواية.
المبرمجة الموت-1 (PD-1) مستقبلات مثبطة على سطح الخلايا التائية ومطلوب من أجل الحد من الاستجابات المفرطة T الخلية. وفي السنوات الأخيرة، قد تورط الأجسام المضادة-PD-1 في علاج الأورام الخبيثة متعددة1،2. ربط PD-1 يقيد العديد من المهام T الخلية، بما في ذلك انتشار والالتصاق وإفراز السيتوكينات متعددة3،،من45. يتم ترجمة PD-1 إلى المشبك المناعية، التفاعل بين خلايا تي وعرض مستضد الخلايا6، حيث أنها كولوكاليزيس مع خلايا تي مستقبلات (تكر)7. وفي وقت لاحق، الفوسفاتيز تيروزين SHP2 [Src التماثل 2 (SH2) المجال الذي يحتوي على تيروزين الفوسفاتيز 2] يتم تجنيده بذيل هيولى PD-1، مما أدى إلى ديفوسفوريليشن من بقايا تيروزين الرئيسية داخل تكر المعقدة وما يرتبط بها الدانية إشارات الجزيئات3،،من45،،من89. ذيل هيولى PD-1 يحتوي على اثنين تيروزين زخارف، إيمونوريسيبتور المستندة إلى تيروزين مثبطة فكرة (عيتيم)، ورمز التبديل على أساس فكرة (ITSM) تيروزين إيمونوريسيبتور10. يتم فوسفوريلاتيد على حد سواء زخارف عند PD-1 ربط9،10. وأظهرت الدراسات الطفرات دور أساسي ل ITSM في التوظيف، مقابل ايتيم، يتمثل دورها في إشارات PD-1 ووظيفة ليست واضحة SHP24.
SHP2 يعتمد أما مغلقة (مطوية)، وتحول دون تكيف أو مفتوح (الموسع)، تكيف النشط11. لا بعد توضيح مساهمة كل مجال ذيل PD-1 لربط SHP2 أو التنشيط. للإجابة على هذا السؤال، قمنا بتطوير مقايسة التي تمكن من اختبار موازية لتوظيف SHP2 بذيل PD-1 وفي النشاط12. استخدمنا co-إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الفوسفاتيز في حبة لاختبار كل من التفاعل والنشاط الأنزيمي بالتوازي. باستخدام هذا الفحص، ونحن تبين أن “مقدمو الخدمات” PD-1 كافية لتوظيف SHP2 بذيل PD-1، بينما يلزم ايتيم PD-1 تماما توسيع وتنشيط الإنزيم.
وهناك العديد من المستقبلات التي لديها العديد من المجالات المجاورة في ذيولها هيولى. يمكن كشف التحليل وظيفية co-إيمونوبريسيبيتيشن دور المجالات المحددة التي ضرورية لتعيين البروتين أو التنشيط الانزيمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التفاعلات مستقبلات إنزيم ذات أهمية حاسمة للإشارات داخل الخلايا. ويتم تجنيد العديد من الإنزيمات المستقبلات من خلال نطاقات SH2 ملزمة إلى تيروسينيس فوسفوريلاتيد التي تزين ذيول مستقبلات نفس. بيد أن الإنزيمات هي غالباً مطوية في والتشكلات الخاملة مغلقة ويتطلب التنشيط تغيير conformational11</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع “منح المعاهد الوطنية للصحة” 1R01AI125640-01 و “مؤسسة أبحاث أمراض الروماتيزم”.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
