3-Nitrotyrosine atmosferik ortamlar üzerinden yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör sistemi tespiti
Summary
Biz bir yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör (HPLC-ECD) kullanarak hava örnekleyici prefilters–dan kesmek 6 mm çaplı mermi ile 3-nitrotyrosine atmosferik proteinlerin kimyasal değişimleri tespit etmek için bir yöntem mevcut.
Abstract
3-nitrotyrosine (3-NT) Tirozin kalıntı atmosferik biyo-aerosol proteinler aracılığıyla bir tepki ile ozon (O3) ve azot dioksit (NO2) içinde oluşturulur. İstikrarlı 3-NT oksidatif hasar için belirli bir belirtecidir ve alerji temin için değerlerinin bir etkisi olduğu bildirilmektedir. Bu da çalışmanın, biyo-aerosol dahil olmak üzere kentsel çevre havadan 3-NT < 2.5 µm partikül madde (PM2.5) toplamak için hava örnekleyici filtrelerindeki ölçmek için son derece hassas bir tahlil gelişimi rapor. Bu yöntemde, 6 mm çaplı yuvarlak delik hava numune filtreler–dan kesmek ve proteinleri hidrolize için özel olmayan bir proteaz kokteyl ile karışık. Amino asit seviyeye sindirilmiş protein örnekleri 3-bir yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör (HPLC-ECD) kullanarak, NT için test edildi. Maksimum 3-NT oranı 7,3 mikron, 4.5 ölçüler PM algılama limitli 1.13 pg/m3için bir prefilter tespit edilmiştir.
Introduction
Aerosol veya hava indirme PM virüsler, prokaryot, mantarlar, bitkiler (polen) ve hayvanlar (böcekler, insan)1de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik kökenli proteinler içerir. Protein içeriği PM içinde oranı neredeyse hangi bir havada alerjen2olarak önemli bir rol oynamak için karıştığı % 5, olduğu tahmin edilmektedir. Son raporlar öneririz bu kentsel ortam aerosol çeşitli boyutları ile % 0,5 ile % 23arasında değişen oranlarda amino asitler içerir. Buna ek olarak, PM proteinlerin kimyasal değişimleri O3, azot dioksit (NO2) ve kükürt dioksit (SO2)4gibi çeşitli kirleticiler ile proteinlerin reaksiyonlar tarafından oluşturulacak önerilmiştir.
3-NT — bir protein değişiklik — Tirozin kalıntıları nitration tarafından oluşturulur. O3 ve hiçbir2 daha yüksek bir konsantrasyon protein molekülleri sözde atmosferik alan5,6nitration tanıtmak için gösterilmiştir. Tirozin kalıntılarında polipeptid zinciri nitration polen proteinler7alerjenik potansiyelini artırır. Böylece, miktar ve hava 3-NT değerlendirmenin çevre sağlığı endişelerini ele önemli bir yönü olduğunu.
Olarak da bilinen bir biyomarker oksidatif, 3 NT ve nitrosative stres8. Kanıt ortaya çıkan bir vücut 3-NT içeriği anlamlı bir ilişki birkaç insan hastalıkları9,10ile göstermiştir. Zararlı etkileri nedeniyle, algılama ve nicel tahmini 3-NT biyolojik örnek bir bireyin sağlık durumunu belirlemede büyük alaka tutun. Son yıllarda, çeşitli yöntemleri enzim bağlı immunosorbent deneyleri, HPLC, 3 NT içeriği tahmin etmek için ortaya konan ve LC/MS11. Önceki çalışmalarda, önceki yöntemlerine göre birçok avantajı ile ihsan HPLC-ECD tekniği kullanarak bir algılama yöntemi bildirdin. Örneğin, HPLC ECD nispeten basit tahlil sistem12oldu bir çekme ya da derivatization yordam gerektirmez. Biz bu yöntem 3-biyolojik örnekleri (plazma üzerinden insan ve fare) NT’den algılamak için uygulanabilir olduğunu doğruladı.
Birçok araştırmalar 3-NT biyolojik örneklerde tespiti vurgulamamıza rağmen onun algılama nonbiological örneklerinde zor kalır ve dolayısıyla da çalışmanın takip edilmiştir. Aslında, havadaki zararlı etkisini değerlendirmek için 3-NT, 3-NT doğrudan doğruya–dan hava parçacıkları tespit etmek yararlı bir nicel yöntemi gereklidir; Bu nedenle, algılamak için varolan HPLC-ECD yöntemi uygulanan 3-NT PM üzerinden2.5 toplanan Cam elyaflı filtre. Kullanarak tekniği, 3 NT doğrudan küçük tespit edilemedi (6 mm çaplı yuvarlak delikler) adet örnek bir PM koleksiyonu filtresinin dışında. Biz daha fazla 3-NT çeşitli PM boyutları için içeriği değerlendirildi ve algılama sınırı 3-NT ölçülür. Mevcut Madde 3-NT doğrudan doğruya–dan nonbiological ve biyolojik örnekler tespit etmek için yüksek-duyarlı ve yüksek işlem hacmi bir yöntem öneriyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede bir miktar yöntemi hava indirme PM Kuvars filtreler son derece hassas HPLC-ECD teknikleri kullanarak toplanan 3-NT değerlendirmektir.
Genel olarak, 3 NT ölçüm yöntemleri insan hastalıklarda oksidatif stres biyolojik olarak geliştirilmiştir. Antikor tabanlı yöntemleri (Örneğin, enzim bağlı immunosorbent assay) yarı kantitatif hiçbir katı tahlil doğrulama ve testin güvenilirliğini değerlendirmek zordur çünkü kabul edilir. HPLC elektrokimyasal algılama (ECD) ve kütle spektrometresi tabanlı deneyleri ile 3-NT13miktar için yeterli hassasiyeti var. Hassas olmalarına karşın, GC-MS gibi kütle spektrometresi tabanlı yöntem veya GC-MS/MS amino asitlerin derivatization gerektirir ve derivatization kez işlem eserler14oluşumunda sonuçlanır.
GC ve LC teknikleri için karşılaştırıldığında, HPLC-ECD nispeten ucuzdur ve ölçü 3 için yeterli bir duyarlılığa sahiptir-NT. Ayrıca, GC-MS ve LC-MS derivatization adımda kez ek süresi gerektirir. Burada sunulan Yöntem 16 saat için protein sindirimi adım gerektirir, ancak bu yine de, gece boyunca dışarıda yapılabilir (yukarıda açıklandığı gibi yaklaşık 30 dakika eller zaman gereklidir örnek). Bir Otomatik Örnekleyici kullanarak otomatik tekrar ölçüm bir yüksek-den geçerek ölçüm sistemi sağlayabilir. Önceki çalışmalar ölçmek için immünolojik Yöntemler bildirdin 3-NT PM2,7; Ancak, bu tür yöntemleri 3-NT PM15seviyesinin düşük nedeniyle kış sezonunda 3-NT algılayamadı.
HPLC-ECD yöntemi diğer standart yöntemler üzerinde ek avantajları vardır; Örneğin, (i) bir ayıklama işlemi bu yöntemde gerekli değildir, (ii) Bu tamamen deterjan ücretsiz, (iii) bu en az örnek gereksinimi vardır ve, önemlisi, (iv) Bu yüksek duyarlılığa sahiptir. Filtreler toplanan parçacıklar sık sonication miktar çeşitli bileşenleri de dahil olmak üzere daha fazla araştırmalar için ayrılır. Deterjanlar da PM bağlı proteinler filtrelerden izole etmek için kullanılır. Ancak, aşağıdaki ek adımları kirlenme, örnek kaybı ve küçümseme ayıklama verimliliği nedeniyle riski artar ve ayrıca, çoğu deterjanlar LC/MS ile uyumsuzdur. Mevcut HPLC-ECD yönteminde HPLC örnekleri kolayca filtresinden basit bir oyuk yumruk kullanarak ve bir ek örnek hazırlama sürecinin zorunluluğu olmadan ayrılabilir. 28,3 mm2orijinal kuvars filtre boyuta göre çok küçüktür, yuvarlak şekilli örnek alanıdır (8 x 10 inç 203.2 x 254 mm = 51,600 mm2=).
HPLC-ECD durumu dikkatlice 3-NT sinyal için bir girişimi engellemek için gözden geçirilmiş12daha önce açıklandığı gibi. Güçlü bir asidik pH mobil faz ve Asetonitril yeterli bir konsantrasyon algılama için önemlidir. Bu koşul kullanma, nitro temel, dahil olmak üzere diğer bileşikler, nitrotyrosine ayrılabilir. Mevcut durumu 3-NT örneklerinden farklı fiziksel özelliği (Örneğin, partiküler madde ve plazma) tespiti için uygundur.
Değerlendirmek için 3-NT havada, filtre ağırlık ölçümü ve arka ortadan kaldırılması önemli adım vardır. Genel olarak, PM7 yaklaşık 100 mg üzerinde bir 4-7 gün boyunca toplanan vardır; Ancak, çeşitli faktörler önce ve sonra nem ve statik elektrik şarj dahil olmak üzere PM7 koleksiyonu filtre ağırlık etkiler. Bu etkilerinden korunmak için filtre ağırlık sabitleme uzun süre subequal sıcaklık ve nem altında gereklidir. Elektron teraziler yüklendiği konum içinde istikrarlı bir ortam sağlanmalıdır. Numune hazırlama için nonspesifik proteaz kokteyl arka plan etkilerinden ve Ultrafiltrasyon membran kez 3-NT benzer bir zirveye göstermek düzeltmek önemlidir.
Bu yöntem kapalı ortamlarda da dahil olmak üzere diğer parçacıklar uygulanabilir. Proteinlerin nitration onların alerjenik potansiyel2artabilir. Bu nedenle, bu yöntem çevre temizlik değerlendirmek ve nitrosative stres önlemek için yardımcı olabilir.
Bu çalışmada, atmosferik 3-NT hava örnekleyici filtre ele kolay ve ucuz aparatı ile son derece hassas ölçüm yöntemi bildirin. 3-NT atmosferde nesil O3, NO2, PM proteinler ve insan alerjenite etkileyen meteorolojik öğeleri gibi çevresel kirleticiler ile ilişkilidir. Sonuç olarak, mevcut soruşturmada geliştirilen Yöntem atmosferik reaksiyon O3, çeşitli kirleticiler ve PM proteinler çeşitli meteorolojik koşullar altında değerlendirmek için yardımcı olabilir. 3-nitrotyrosine atmosferde bir tahmini için HPLC-ECD geliştirme bu çabaları ile biz daha iyi çevre temizlik, insan sağlığının iyileştirilmesi tahmin.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Masayuki Kubo, ABD Çevre koruma ajansı çay kaşığı/PM2.5 örnekleme ile yardım için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen JSP’ler KAKENHI Grant numarası JP16K15373 ve JP18H03039 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
References
- Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
- Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
- Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
- D’Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
- Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
- Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
- Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
- Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).
- Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
- Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?. Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
- Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
- Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
- Ogino, K., Wang, D. -. H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
- Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
