Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Säugerzellen unterliegen mechanischen, osmotische und biochemischer Stress, was zum Verlust der Integrität der Plasmamembran. Ohne schnelle und effiziente Wiederverschließen, würde geschädigte Zellen programmierten oder nekrotischen Tod schnell erliegen. Seit den 1960er Jahren haben Bemühungen um die Plasmamembran Wiederverschließen Prozess verstehen von den verheerenden Folgen, verbunden mit seiner Funktionsstörungen motiviert. In der Tat sind Krankheiten wie Muskeldystrophie Limb-Gürtel, Diabetes und Chediak-Higashi-Syndrom mit mangelhaft Plasmamembran Reparatur durch Mutationen im gen Kodierung Dysferlin, Produktion von advanced Glycation Endprodukte und defekte verbunden worden die lysosomalen Menschenhandel Regler CHS1, bzw.^1,2,3,4,5,6. Allerdings ist bislang, unser Verständnis der Membran Wiederverschließen nach wie vor begrenzt⁷. Erste Studien haben gezeigt, dass die Membran Wiederverschließen durch den Zustrom von extrazellulären Ca^{2 +} durch die beschädigte Plasmamembran^8,9,10initiiert wird. Seitdem sind mehrere nicht gegenseitig Ca^{2 +}-abhängige Mechanismen sind vorgeschlagen worden, um Zellen zu versiegeln. Die Patch-Hypothese schlägt vor, in der Nähe der Wunde, intrazelluläre Vesikeln miteinander und die beschädigten Plasmamembran verschmelzen zu handeln als ein Patch^11,12,13,14. Ein zweites Modell schlägt vor, dass Kalzium-abhängige Exozytose Website Versionen von Lysosomen an der Wunde des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, die Sphingomyelin Ceramid im äußeren Merkblatt der Plasmamembran umwandelt. Diese plötzliche Änderung in der Lipidzusammensetzung führt Ceramid-driven Endozytose von der beschädigten Region^15,16,17. Schließlich geht der dritte vorgeschlagene Mechanismus eine Rolle für die Endosomal Sortierung komplexer erforderlich für den Transport (ESCRT) Förderung die Bildung von Vesikeln nach außen gerichtete, die Weg von der Plasmamembran¹⁸Knospe. Nur eine begrenzte Anzahl von Proteinen in diesen Modellen identifiziert wurde, und ihre Maschinen muss weiter aufgeklärt.

Hier beschreiben wir einen Hochdurchsatz-Assay, den Maßnahmen der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz bei anhaftenden Säugerzellen unterzogen um zu Schäden durch rekombinante Listeriolysin O (LLO)¹⁹vermittelt. LLO ist eine Pore-forming Toxin (PFT) abgesondert von der fakultativen intrazellulären Erreger Listeria Monocytogenes^20,21,22 und gehört zu den MACPF/CDC (Membrane Angriff komplex, Perforin, und Cholesterin-abhängige Cytolysin)-Superfamilie. MACPF sind Säugetiere Pore-forming Proteine beteiligt, Immunabwehr, während CDCs bakterielle Toxine hauptsächlich sind produziert durch gram-positive Erreger, die Wirtszellen zur Förderung ihrer pathogenen Lebensstile²³beschädigen. CDCs sind als wasserlösliche Monomere synthetisiert oder Dimere, die an Cholesterin binden in der Plasmamembran und oligomerize zu einem prepore Komplex von bis zu 50 Untereinheiten. Komplexe Prepore ordnet dann um β-Stränge über die Lipid-Bilayer bildet eine β-Fass-Pore, die 30-50 nm im Durchmesser^24,25,26,27umfasst einzufügen.  Diese großen Poren erlauben Fluten von Ionen und kleine Zellkomponenten innerhalb und außerhalb der Zelle; jedoch haben einige Studien vorgeschlagen, Poren kleiner Größen auch gebildete^{28,29,30 sind}. Unter die CDCs zeigt LLO einzigartige Eigenschaften einschließlich irreversible pH-Wert und Temperatur-abhängige Aggregation, die förderlich für Hochdurchsatz-Analysen^31,32ist. LLO kann Zellkulturmedium bei 4 ° c, eine Temperatur, die freizügig ihre Bindung an Zellen, aber nicht zur Bildung von komplexen Pore hinzugefügt werden. Einleitung der Porenbildung kann dann synchronisiert werden, durch Erhöhung der Temperatur um 37 ° c, so dass für die effiziente Verbreitung der Toxin-Moleküle in der Ebene der Membran zu Form Oligomere und zum Konformationsänderungen Umbau Pore Generation beteiligt. Daher wird nach dem Wechsel der Temperatur, der kinetische Zellschäden die Menge des Toxins an die Plasmamembran gebunden abhängen. Vor allem lösliche LLO (nicht an der Plasmamembran gebunden) rasch und irreversibel aggregiert, wenn die Temperatur 37 ˚C erreicht die verringert die Notwendigkeit ungebundenes Toxin Moleküle abzuwaschen und das Ausmaß der Membranschäden im Laufe der Zeit. Zu guter Letzt, weil LLO an Cholesterin bindet und Cholesterin-reiche Membranen Poren bildet, ist dieser Assay offen für eine Vielzahl von Säugerzellen. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, die LLO betrifft Wirtszelle Signalisierung hauptsächlich über Porenbildung, mit wenigen Ausnahmen in die Pore-unabhängige Zelle Signalisierung kann auftreten,^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Es kann also nicht sein, dass LLO Signalisierung Aktivitäten beeinflussen den Prozess der Membran Reparatur ausgeschlossen.

Dieser Assay bewertet direkt das Ausmaß der Zelle Verwundung durch Messung der Einbau von einer Zelle impermeant Fluorochrom (z.B. Propidium Jodid), die passiv verletzte Zellen und wird stark fluoreszierende, sobald es mit Nukleinsäuren assoziiert . Daher kann die Fluorochrom in Zellkulturmedium während das Experiment, so dass Echtzeitanalysen der Zelle Verwundung gepflegt werden. Der Fluoreszenzintensität des Farbstoffs Nukleinsäure-Bindung erhöht die Konzentration des Toxins und für eine bestimmte Konzentration des Toxins wird im Laufe der Zeit erhöhen, bis alle Poren gebildet werden und Zellen sind vollständig repariert oder Sättigung erreicht ist. Der Zustrom von extrazellulären Ca^{2 +} Poren der Membran ist eine conditio Sine Qua Non -Event für Wiederverschließen. Daher die resealing Effizienz kann indirekt nachgewiesen durch den Vergleich Zelle Verwundung in Kulturmedium mit Ca^{2 +} (permissive Reparaturbedingung), Verwundung in einem Ca^{2 +}-freie Mitte (Reparatur einschränkende Bedingung). Da der Fluoreszenzintensität der Nukleinsäure-Bindung Farbstoff direkt proportional zu der Zellkonzentration in jedes gut ist, ist es wichtig, Samenzellen bei der gleichen Konzentration in alle Wells. Es ist auch wichtig, Zellen in jedem gut vor und nach der Test um sicherzustellen, dass die Zelle Ablösung tritt nicht auf, als schwimmende, aggregierte Zellen Fluoreszenz Lesungen verdecken können die Interpretation der Daten erschweren kann, aufzählen. Um Zellen aufzuzählen, wurden Zellen mit dem Ausdruck ihrer nuklearen lokalisiert Histon 2 b-GLP (H2B-GFP) in diesem Test verwendet. Temperaturgeführte, Multimode, kombinieren Mikrotestplatte Leser schnelle Hochdurchsatz-Messungen (mit einem 96 oder 384-Well-Plattenformat) Fluoreszenz-Intensitäten mit Mikroskopie-Bildgebung von lebenden Zellen bei 37 ° C. Letzteres kann verwendet werden, zum Auflisten der Zellzahl und die eventuelle Bildung von unterschiedlichen Zellpopulationen zu beobachten.

Letztlich dieser Assay bietet dem Anwender die Möglichkeit, ihr Wissen über die Komplexität der Membran Reparaturmechanismen durch Screening für Host-Moleküle zu erweitern oder exogen zusätzliche Verbindungen, die Membran steuern können zu reparieren. Das folgende Protokoll beschreibt die experimentellen Schritte, um die resealing Effizienz der Zellen, LLO messen und bewerten die Auswirkungen einer bestimmten Droge oder zellulären Behandlung auf Wiederverschließen Effizienz.