שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן אוטומטי את ביצועי גינקולוגיות דרוזופילה -שינוי הטמפרטורות באמצעות לתכנות מבוקרי טמפרטורה ארנה שמייצר שינויי טמפרטורה מהירים ומדויקים בזמן ובמרחב.
Abstract
הטמפרטורה היא גורם סביבתי בכל מקום זה משפיע על איך מינים להפיץ ולהתנהג. מינים שונים של זבובי דרוזופילה פירות יש תגובות ספציפיות לשינוי הטמפרטורות בהתאם הסתגלות סובלנות הפיזיולוגית שלהם. זבובים דרוזופילה בעלי גם חום חישה מערכת הפך בסיסי להבנת הבסיס העצבי של טמפרטורת עיבוד ב- ectotherms. אנו מציגים כאן ארנה מבוקרי טמפרטורה המאפשרת שינויי טמפרטורה מדויקת ומהירה עם שליטה הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי כדי לחקור את התגובה של זבובים בודדים את שינוי הטמפרטורה. זבובים בודדים להציב בזירה, נחשפים אתגרים טמפרטורה מתוכנתים מראש, כגון הדרגתי אחיד מגביר טמפרטורה כדי לקבוע נורמות התגובה או טמפרטורות המפוזרים במרחב בו זמנית כדי לקבוע העדפות. אנשים מתבצע באופן אוטומטי, המאפשר כימות של העדפה מהירות או מיקום. בשיטה זו ניתן לכמת במהירות התגובה על מגוון רחב של טמפרטורות כדי לקבוע טמפרטורה ביצועים עקומות דרוזופילה או חרקים אחרים באותו סדר גודל. בנוסף, זה יכול לשמש עבור מחקרים גנטיים לכמת טמפרטורה העדפות ותגובות של מוטציות או פראי-סוג זבובים. שיטה זו יכולה לעזור לחשוף את הבסיס של היווצרות המינים תרמי, הסתגלות, כמו גם המנגנונים העצביים העומדים מאחורי בטמפרטורה.
Introduction
טמפרטורה היא גורם סביבתי מתמיד זה משפיע על איך אורגניזמים לפעול ולהתנהג1. הבדלי גובה ורוחב להוביל הבדלים בסוג באקלים האורגניזם נחשפים, שתוצאתה בחירה אבולוציונית לתגובתם טמפרטורה2,3. האורגניזמים להגיב טמפרטורות שונות דרך עיבודים מורפולוגי, פיזיולוגיים והתנהגותיים זה למקסם ביצועים תחת שלהם מסוים סביבות4. לדוגמה, זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster, אוכלוסיות מאזורים שונים יש העדפות טמפרטורה שונות, הגוף גדלים, פעמים התפתחותית, אריכות-חיים, פוריות וביצועים הליכה בטמפרטורות שונות2 ,5,6,7. המגוון שנצפה בין הזבובים ממוצא שונה מוסבר בחלקו על ידי וריאציה גנטית גן פלסטיק הביטוי8,9. באופן דומה, מינים דרוזופילה מאזורים שונים להפיץ באופן שונה בין מעברי צבע טמפרטורה ולהראות הבדלים ההתנגדות החום הקיצוני, בדיקות קר10,11,12.
דרוזופילה הפך גם לאחרונה מודל הבחירה כדי להבין את הבסיס הגנטי והעצבים של טמפרטורה תפיסה13,14,15,16,17. באופן כללי, הזבוב הבוגר תופסים טמפרטורה באמצעות חיישני טמפרטורה היקפיים קרים וחמים, מחושיהם ודרך חיישני טמפרטורה15,16 14,13,המוח , 17 , 18 , 19 , 20. קולטני הפריפריה לטמפרטורות חם אקספרס Gr28b.d16 או Pyrexia21, תוך הפריפריה מאופיינים קולטנים קר Brivido14. במוח, טמפרטורה מעובד על ידי נוירונים לבטא TrpA115. מחקרים התנהגותיים על מוטציות של המסלולים הללו משתפרים הבנתנו כיצד מעובד בטמפרטורה ולתת תובנות מנגנונים משתנים בין אוכלוסיות של דרוזופילה ממחוזות שונים.
כאן נתאר ארנה מבוקרי טמפרטורה שמייצר שינויי טמפרטורה מדויקת ומהירה. חוקרים יכולים מראש תכנית שינויים אלה, אשר מאפשר מניפולציות טמפרטורה סטנדרטית ו הדיר ללא התערבות אנושית. זבובים הם הקליטו, במעקב עם תוכנות מיוחדות כדי לקבוע את המיקום שלהם ואת המהירות בכל השלבים השונים של ניסוי. המדד העיקרי הוצג פרוטוקול זה הוא מהירות הליכה בטמפרטורות שונות, כי הוא אינדקס רלוונטי מבחינה אקולוגית בביצועים פיזיולוגיים ניתן לזהות הסתגלות תרמיות בודדות5. יחד עם טמפרטורה קולטן מוטציות, טכניקה זו יכולה לסייע לחשוף את המנגנונים של עיבוד תרמי ברמה התאית וביוכימי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן הובאו אוטומטיים מבוקרי טמפרטורה זירה (איור 1) שמייצר שינויי טמפרטורה מדויקת בזמן ובמרחב. שיטה זו מאפשרת חשיפה של הפרט דרוזופילה מחיישנים מגביר הדרגתית של הטמפרטורה (איור 2 , איור 3) אלא גם לאתגרים טמפרטורה דינמי שבו כל אריח של הזירה ז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מלגה Behavioural, תוכנית קוגניטיבי מדעי המוח של אוניברסיטת של חרונינגן, במלגה ללימודי תואר שני, y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnología (CONACyT) במקסיקו, כמובן מאליו אנדריה סוטו-פאדילה, במענק מטעם קרן טמפלטון ג’ון לחקר הזמן הוענק Hedderik ואן ריין, ז’אן כריסטוף Billeter. אנחנו גם אסיר תודה פיטר חריט Bosma בשל השתתפותו בפיתוח הגשש FlySteps .
ניתן למצוא קבצי script TemperaturePhases, FlySteps, ו FlyStepAnalysis כמידע משלים, הקישור הבא זמני וזמין לציבור:
https://dataverse.nl/privateurl.xhtml?token=c70159ad-4d92-443d-8946-974140d2cb78
Materials
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Software RUG |
| Electronics Board | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-Main-02-2014 | |
| Power supply Boost | XP-Power 48. V 65 W | ECS65US48 | Set to 53 Volt |
| Power supply Tile Heating | XP-Power 15. V 80 W | VFT80US15 | |
| Power supply Cooling | XP-Power 15. V 130 W | ECS130U515 | |
| Peltier elements | Marlow Industries | RC12-4 | 2 Elements, controlled DC feed |
| Heat sink | Fisher Technik | LA 9/150-230V | Decoupled for vibration |
| Temperature sensors | Measurement Specialties | MCD_10K3MCD1 | Micro Thermistor Probe |
| Copper block/tiles | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-CB-01-2014 | |
| Auminum ring | Ruijsink Dynamic Engineering | FF-RoF-02-2015 | |
| Tesa 4104 white tape 25 x 66 mm | RS Components | 111-2300 | White conductive tape |
| Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
| Warm white LED strip | Ledstripkoning | HQ-3528-SMD | 60 LEDs per meter |
| Switch Power Supply | Generic | T-36-12 | |
| Logitech c920 | Logitech Europe S.A | PN960-001055 | |
| QuickTime Player | Apple Computer | Recording program | |
| Tracking analysis software | R | Packages: pacman | |
| Tracking analysis software | MATLAB | ||
| Thermal Imaging | FLIR T400sc | ||
| Graphs and Statisticts Software | Graph Pad Prism | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | Siliconising agent |
| Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
| Flypad | Flystuff | 59-114 | |
| Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
| Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
| Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
| Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
| Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
| Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
| Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
| Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
| Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
| Molasses | Flystuff | 62-117 | |
| Active dry yeast | Red Star | ||
| Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
References
- Abram, P. K., Boivin, G., Moiroux, J., Brodeur, J. Behavioural effects of temperature on ectothermic animals unifying thermal physiology and behavioural plasticity. bioRxiv. , (2016).
- Rajpurohit, S., Schmidt, P. S. Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior. Fly. 10 (4), 149-161 (2016).
- Jezovit, J. A., Levine, J. D., Schneider, J. Phylogeny environment and sexual communication across the Drosophila genus. The Journal of Experimental Biology. 220 (1), 42-52 (2017).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in Thermal Performance among Insect Populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gibert, P., Huey, R., Gilchrist, G. Locomotor performance of Drosophila melanogaster: Interactions among developmental and adult temperautures, age, and geography. Evolution. 55 (1), 205-209 (2001).
- Trotta, V., et al. Thermal plasticity in Drosophila melanogaster: A comparison of geographic populations. BMC Evolutionary Biology. 6, 1-13 (2006).
- Klepsatel, P., Gálikova, M., De Maio, N., Huber, C. D., Christian, S., Flatt, T. Variation in thermal performance and reaction norms among populations of Drosophila melanogaster. Evolution. 67 (12), 3573-3587 (2013).
- Latimer, C. A. L., Wilson, R. S., Chenoweth, S. F. Quantitative genetic variation for thermal performance curves within and among natural populations of Drosophila serrata. Journal of Evolutionary Biology. 24, 965-975 (2011).
- Chen, J., Nolte, V., Schlotterer, C. Temperature-related reaction norms of gene expression: Regulatory architecture and functional implications. Molecular Biology and Evolution. , (2015).
- Kellermann, V., Overgaard, J., Hoffmann, A. A., Flojgaard, C., Svenning, J. -. C., Loeschcke, V. Upper thermal limits of Drosophila are linked to species distributions and strongly constrained phylogenetically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16228-16233 (2012).
- Andersen, J. L., Manenti, T., Sørensen, J. G., Macmillan, H. A., Loeschcke, V., Overgaard, J. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Krstevska, B., Hoffmann, A. A. The effects of acclimation and rearing conditions on the response of tropical and temperate populations of Drosophila melanogaster and D. simulans to a temperature gradient (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Behavior. 7 (3), 279-288 (1994).
- Frank, D. D., Jouandet, G. C., Kearney, P. J., Macpherson, L. J., Gallio, M. Temperature representation in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 358-361 (2015).
- Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in Drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
- Liu, W. W., Mazor, O., Wilson, R. I. Thermosensory processing in the Drosophila brain. Nature. 519 (7543), 353-357 (2015).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 Regulates Thermal Nociception in Drosophila. Public Library of Science ONE. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhong, L., et al. Thermosensory and non-thermosensory isoforms of Drosophila melanogaster TRPA1 reveal heat sensor domains of a thermoTRP channel. Cell Reports. 1 (1), 43-55 (2012).
- Barbagallo, B., Garrity, P. A. Temperature sensation in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 34, 8-13 (2015).
- Tang, X., Platt, M. D., Lagnese, C. M., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Temperature integration at the AC thermosensory neurons in Drosophila. Journal of Neuroscience. 33 (3), 894-901 (2013).
- Petavy, G., David, J. R., Gibert, P., Moreteau, B. Viability and rate of development at different temperatures in Drosophila: A comparison of constant and alternating thermal regimes. Journal of Thermal Biology. 26 (1), 29-39 (2001).
- Diegelmann, S., Zars, M., Zars, T. Genetic dissociation of acquisition and memory strength in the heat-box spatial learning paradigm in Drosophila. Learning & Memory. 13 (1), 72-83 (2006).
- Zars, M., Zars, T. High and low temperatures have unequal reinforcing properties in Drosophila spatial learning. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 192 (7), 727-735 (2006).
- Zars, T., Wolf, R., Davis, R., Heisenberg, M. Tissue-specific expression of a type I adenylyl cyclase rescues the rutabaga mutant memory defect: in search of the engram. Learning & Memory. 7 (1), 18-31 (2000).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Brain Research. 46 (5), 320-325 (2011).
