Detección y aislamiento de cuerpos apoptóticos de alta pureza

Apoptosis, una forma bien estudiada de muerte celular programada, es necesaria para mantener la homeostasis fisiológica y eliminar células potencialmente dañinas en el cuerpo humano¹. Después de la inducción de la apoptosis, las células apoptotic (ApoCells) pueden someterse a una serie de cambios morfológicos y desmontar en pequeñas vesículas de membrana denominadas ApoBDs. En general, este proceso se conoce como desmontaje de la célula apoptótica y puede dividirse en 3 pasos distintos basados en morfología^2,3. Paso 1 (membrana del plasma blebbing) se caracteriza por la formación de globo-como las estructuras en la superficie de la célula conocido como ampollas^4,5. Paso 2 (formación de protusión apoptóticos) incluye la formación de protrusiones de membrana larga como apoptopodia, apoptopodia de cuentas y microtúbulos picos^6,7,8. Por último, el paso 3 (formación ApoBD) incluye la fragmentación de la apoptosis protuberancias o ApoCells para generar ApoBDs^6,9. Los resultados anteriores han sugerido un papel de ApoBDs en ayudar a la separación de células apoptotic y mediar la comunicación intercelular. Por ejemplo, se propone que la fragmentación de un ApoCell en ApoBDs puede generar pequeñas cantidades de ‘pequeñas’ que podrían eliminarse fácilmente rodeando los fagocitos^2,10,11. Además, ApoBDs puede albergar una serie de biomoléculas como el DNA, RNA y proteínas, que pueden ser víctimas de la trata a las células circundantes para facilitar la comunicación de célula^12,13,14. Para funcionalmente investigar estos procesos, es vital para confirmar tres parámetros fundamentales, incluyendo (i) validación de inducción de apoptosis y la formación de ApoBD, (ii) aislamiento de ApoBDs y (iii) confirmación de pureza ApoBD.

Previamente, una serie de métodos como citometría de flujo y microscopia electrónica se ha utilizado para estudiar la apoptosis y ApoBDs^15,16,17,18. Sin embargo, cuantificación y detección de ApoBD son a menudo difíciles o se pasa por alto. Por ejemplo, la apoptosis basados en citometría de flujo del utilizan más habitualmente análisis emplea anexina V (A5, una proteína que se une el externalizados ‘ comer-me’ señal fosfatidilserina (PtdSer)) y ácidos nucleicos de la mancha (PI) el yoduro de propidio¹⁹. Sin embargo, mediante el uso de esta combinación de tinte universal, análisis asume que hay solamente tres tipos de subconjuntos de la célula (células viables, ApoCells y células necróticas) en la muestra. Además, aunque se considera como “estándar de oro” por muchos investigadores para apoptosis, ensayos de citometría de flujo y análisis de datos posteriores a menudo excluyen ApoBDs a través de un primer paso bloquea seleccionar eventos de^{intermedio-alto} FSC/SSC. Por ello, recientemente hemos desarrollado un análisis de citometría de flujo novela con A5 y PRO-TO-3, otra mancha nucleico que puede ser selectivamente tomada por caspasas 3/7-activa pannexin 1 (PANX1) canales^7,20. Como la activación de caspasas inducida por 3 PANX1 precede PtdSer exposición en la etapa temprana de la apoptosis, TO-PRO-3 manchas diferencialmente apoptotic y células necróticas. Además, este acercamiento combinado con nuestra novela gating estrategia incluye eventos todos adquiridos durante el análisis de datos y como resultado, se identifican seis subconjuntos de la célula/de la partícula, incluyendo: (i) las células viables (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^bajo , TO-PRO-3^bajo), (ii) A5^– ApoCells temprano (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^bajo,^intermedioPRO-TO-3), (iii) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^alta , TO-PRO-3^intermedia), células necróticas (iv) o ApoCells finales (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^alta,^altaTO-PRO-3), (v) ApoBDs (FSC/SSC^baja, A5^intermedio, TO-PRO-3^{bajo / intermedio}) y (vi) escombros (FSC/SSC^bajo, A5^bajo,^bajaPRO-TO-3)²⁰. Nuestro enfoque destaca la importancia de analizar todos los subconjuntos de células/partícula y, más importante aún, la separación de ApoBDs de las células y desechos²⁰. Por lo tanto, este enfoque demuestra una técnica eficiente para validar la inducción de la apoptosis y ApoBD formación simultáneamente.

Tradicionalmente, ApoBDs han sido aislados a través de una variedad de métodos de centrifugación diferencial por el que ApoBDs se puede separar de las células u otras vesículas extracelulares basadas en densidad. Sin embargo, tales métodos de centrifugación a menudo están limitadas por la baja ApoBD pureza, falta de un paso de cuantificación para confirmar la pureza de la muestra, o incapacidad para separar células específicas del tipo ApoBDs^17,21,22. Por lo tanto, hemos desarrollado recientemente dos enfoques, basados en un FACS y un nuevo enfoque basado en la centrifugación diferencial que puede ser juntado con nuestro método de citometría de flujo previamente establecido para validar la inducción de apoptosis y muestra pureza²³. Aislamiento de ApoBD a través de nuestro enfoque basado en el FACS puede enriquecer ApoBDs hasta 99% de pureza y puede acoplarse con una variedad de anticuerpos de tipo específico para aislar ApoBDs de poblaciones de células mixtas, muestras de tejidos y fluidos corporales²³. Además, nuestro enfoque de centrifugación diferencial revisado demuestra un método eficiente para aislar ApoBDs al > 90% pureza²³.

En este papel, describimos en detalle nuestro procedimiento experimental para validar la inducción de apoptosis y para detectar y cuantificar la formación de ApoBD. Los flujos de trabajo de aislamiento de ApoBD métodos basados en FACS y diferencial basado en la centrifugación también son elaborados y comparados. Los datos representativos demuestran que la metodología descrita proporciona una eficaz herramienta de vanguardia para estudios futuros de ApoBD.