לכימות שינויים חריפה בפעילות העצבים הסימפתטית כליות בתגובה מניפולציות במערכת העצבים המרכזית בחולדות מורדם
Summary
שיטות למדידת תגובות סימפטי ואת הלב וכלי הדם מערכת העצבים המרכזית (CNS) מניפולציות חשובים לקידום מדעי המוח. פרוטוקול זה פותחה כדי לסייע למדענים מדידה וכימות שינויים חריפה בפעילות כליות העצבים הסימפתטית (RSNA) בחולדות מרדימים (ההישרדות).
Abstract
פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA), כלומר לחץ הדם בעורק הינם פרמטרים חשובים אוטונומי וכלי מחקר; עם זאת, ישנם משאבים מוגבלים בימוי מדענים טכניקות מדידה וניתוח של משתנים אלה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות למדידת RSNA ובלחץ עורקי רשע בחולדות מורדם. הפרוטוקול כוללת גם את הגישות לגישה אל המוח במהלך ההקלטות RSNA מניפולציות במערכת העצבים המרכזית (CNS). טכניקת הקלטה RSNA היא תואמת לתרופתי, optogenetic, או גירוי חשמלי של מערכת העצבים. הגישה היא שימושית כאשר חוקר ימדוד לטווח קצר (דקה כדי h) תגובות אוטונומי בניסויים ההישרדות כדי לתאם אנטומית עם גרעינים CNS. הגישה אינה מיועדת לשמש כדי להשיג הקלטות כרונית (הישרדות) של RSNA בחולדות. הפרשות ב RSNA, בממוצע לתקן RSNA ולאחר לחץ עורקי רשע יכול להיות לכמת וניתח נוסף באמצעות בדיקות סטטיסטיות פרמטרית. שיטות לקבלת גישה ורידית, הקלטה רשע לחץ הדם בעורק telemetrically של המוח קיבוע לבדיקה היסטולוגית בעתיד גם מתוארים במאמר.
Introduction
גילויים ניסויים פרה-קליניים על שליטה אוטונומי של מערכת הלב וכלי הדם להודיע אסטרטגיות לניהול הפרעות כגון יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, מחלת כליות כרונית. פעילות יתר של מערכת העצבים הסימפתטית, מופחתת הטון הלב vagal לתרום לחץ דם גבוה (BP)1. מוגברות באופן כרוני יצוא סימפטי כליות מגבירה את הפרשת קטכולאמין ומקטינות את זרימת הדם כליות, עם השלכות מזיקות מערכות לב וכלי דם/כליות2,3. כדי להגדיר את המסלולים הנוירוביולוגי המובילים תפקוד אוטונומי, מחקרים בחולדות חשובים בקביעת כיצד נוירונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) להסדיר פרמטרים סימפטי. המטרה של פרוטוקול זה היא לספק מידע טכני על מדידת פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) ולחץ הדם, חלוקה לרמות טכניקות לכימות בתגובה CNS מניפולציות בחולדות ומורדמת חריפה לשינויים סימפטי.
(ההישרדות) חריפה RSNA מדידות (שנמשך דקות ל- h) שימושיות כאשר מדענים שמחשבי מערכת העצבים פרמקולוגית, חשמלית, או optogenetically ב. מורדם חולדות כדי לקבוע את הפונקציות של גרעינים ספציפיים. בשיטות אלה, מבנים כגון לגרעין בודד, אפור periaqueductal, pedunculopontine tegmentum, rostral לשד ventrolateral נחקרו להגדרת מסלולים הנוירוביולוגי ויסות פרמטרים סימפטי4, 5,6,7. גישה זו חשובה לזיהוי מטרות CNS שתהיה חקירה נוספת במודלים כרונית של חוסר תפקוד אוטונומי8,9. להשלמת ניסויים אלה, המעבדה מחייבת את המלחם מיקרוסקופ כירורגי, מסגרת stereotaxic, מגבר microelectrode, צג השמע. בהתאם הגורמים נוכח במעבדה שתורמים רעש חשמלי, האזור כירורגי/הקלטה עשויים לדרוש של פאראדיי כלוב/הארקה רצועה להפחית את הרעש חשמל בהקלטה RSNA. אם המוח ניתוחים ידרוש קיבוע הרקמה, ברדס משאבת, fume זלוף נדרשים. נתונים יכול להיות דיגיטציה והקליט באמצעות מספר תוכנות הפיזיולוגיות/נתונים רכישה (ממיר אנלוגי-דיגיטלי) יחידות4,5, עם אפשרויות ניתוח שונה compatibilities לכלילת אותות telemetric .
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים למדידת RSNA כוללים: (1) הימנעות מתיחה של עורק הכליה ואת העצבים בעת הפרדת הכליה של השריר paraspinal בעת הנחת על קטע העצב על האלקטרודות הקלטה, לנתח בזהירות (2) סיבי העצב כליות מכלי הקיבול/הרקמה שמסביב, (3) להבטיח כי האלקטרודה חוטים הינם ללא רקמת דם או נוזל הלימפה, (4) מניעת העצב ממנו להתייבש …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי למחקר סיעוד (K99/R00NR014369).
Materials
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O’Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity?. International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , (2018).
