Salmonella spp. /Shigella spp. är vanliga patogener tillskrivs diarré. Här, vi beskriver en hög genomströmning plattform för screening av Salmonella spp. /Shigella spp. med realtids-PCR kombinerat med guidade kultur.
Fekal-oral överföring av akut gastroenterit förekommer emellanåt, särskilt när människor som hanterade mat och vatten är smittade av Salmonella spp./Shigella spp. Den gyllene standard metoden för detektion av Salmonella spp./Shigella spp. är direkt kultur men det är arbetskrävande och tidsödande. Här beskriver vi en hög genomströmning plattform för Salmonella spp./Shigella spp. screening, med realtid polymeras-kedjereaktion (PCR) i kombination med guidade kultur. Det finns två huvudfaser: realtids-PCR och guidade kultur. För den första etappen (realtids-PCR), vi förklarar varje steg i metoden: prova samling, före berikning, DNA-extraktion och realtids-PCR. Om realtids PCR resultatet är positivt, då det andra steget (guidade kultur) utförs: selektiv kultur, biokemisk identifikation och serologiska karakterisering. Vi illustrerar också representativa resultat genereras från den. Protokollet beskrivs här skulle vara en värdefull plattform för snabb, särskilda, känsliga och high-throughput screening av Salmonella spp. /Shigella spp.
Diarré är fortfarande ett vanligt hälsoproblem med hög incidens Betygsätt globalt1,2. Även dödligheten är relativt låg, vissa patienter uppvisar olika symtom i veckor (såsom lös och vattnig avföring, en brådska att gå på toaletten), som gör de samhällsekonomiska konsekvenser mycket hög3,4. Mer allvarligt, vissa patienter kan även utveckla colon irritabile om de lämnas obehandlade5. Det finns olika typer av bakterier, virus och parasiter som kan orsaka diarré6. Salmonella spp. /Shigella spp. är bland de vanligaste bakterierna för överföring av akut gastroenterit7,8,9,10,11. Därför många län har utfärdat lagar eller bestämmelser för regelbundna Salmonella spp. /Shigella spp. screening bland människor som skulle hantera mat och vatten. Till exempel den kinesiska regeringen har utfärdat lagar för obligatorisk Salmonella spp. /Shigella spp. screening en gång om året.
Metoden guldmyntfoten för Salmonella spp. /Shigella spp. upptäckt är bakterier kultur. Genom bakterier kultur och successiva biokemiska identifiering och serologiska karakterisering, kan vi identifiera arterna av bakterier, som kunde underlätta utbrottet sjukdomshantering och antimikrobiella profilering för att underlätta behandling av patienter 12. det kan också hjälpa spåra smittkällan under den Salmonella spp. /Shigella spp. utbrott13. Denna metod är dock arbetsintensiva (som kräver manuell drift) och tidskrävande (tar flera dagar), särskilt för testning av ett stort antal prover7. Dessutom lönsamt men icke-odlingsbara (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kan förekomma i vissa avföringsprov14. Med tanke på dessa nackdelar, många laboratorier har försökt att utveckla ny teknik för detektion av Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. alla dessa metoder använder kärnkraft acid amplification testet (Norling), bland vilka polymeras-kedjereaktion (PCR) är den vanligaste. En stor begränsning av dessa NAAT baserade metoder är att döda bakterier, även bakteriell skräp som innehåller ofullständiga genomiskt DNA, kunde visa positiva resultat26, som till stor del kan påverka korrekt diagnos av sjukdom. Blanco et al. visade att molekylär analys är mycket känsliga, inte bara lönsamt Salmonella i kulturer, men också att partiell genomen och olönsamma eller döda bakterier från tidigare infektioner eller kontaminering26. Ny teknik bör därför utarbetas.
Här, beskrivit vi ett nya metoden att kombinerar NAAT metod och odling. Som visas i figur 1, denna nya metod gäller realtids-PCR screening först och sedan positiva prover skickas för bakterier kultur och identifiering.
Sedan Salmonella spp. /Shigella spp. förknippas ofta med matförgiftning och fekal-oral överföring av akut gastroenterit28,29 och rutinmetoden är antingen arbetsintensiva eller tidskrävande 7, beskriver vi en hög genomströmning plattform efter Salmonella spp. /Shigella spp. screening, med realtids-PCR kombinerat med guidade kultur.
I området i närheten finns det flera…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av vetenskapen och teknik programmet i Zhuhai, Kina (grant nummer 20171009E030064), vetenskapen och teknik programmet av Guangdong, Kina (grant nummer 2015A020211004) och vetenskap och teknik programmet av allmän Administration av Quality Supervision, Inspection and Quarantine av folkets republik av Kina (grant nummer 2016IK302, 2017IK224).
Tris | Sigma | 10708976001 | |
EDTA | Sigma | 798681 | |
NP40 | Sigma | 11332473001 | |
ddH2O | Takara | 9012 | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
XLD | LandBridge | CM219 | |
MAC | LandBridge | CM908 | |
Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
slide | Mingsheng | 7102 | |
micro-loop | Weierkang | W511 | |
incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
autoclave | AUL | SS-325 | |
dry bath | Jinghong | KB-20 | |
automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |