Salmonella spp. /Shigella spp. er fælles patogener tilskrives diarré. Her, vi beskriver en høj overførselshastighed platform for screening af Salmonella spp. /Shigella spp. ved hjælp af real-time PCR kombineret med guidet kultur.
Fækal-oral transmission af akut gastroenteritis forekommer fra tid til anden, især når folk, der håndteres fødevarer og vand er smittet med Salmonella spp./Shigella spp. Guld standard metoden til påvisning af Salmonella spp./Shigella spp. er direkte kultur, men dette er arbejdskrævende og tidskrævende. Her beskriver vi en høj overførselshastighed platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, ved hjælp af real-time polymerase kædereaktion (PCR) kombineret med guidet kultur. Der er to større faser: real-time PCR og guidet kultur. For den første fase (real-time PCR) vi forklare hvert trin i metoden: prøve samling, før berigelse, DNA-ekstraktion og real-time PCR. Hvis real-time PCR er positiv, så den anden fase (guidede kultur) udføres: selektiv kultur, biokemiske identifikation og serologiske karakterisering. Vi også illustrere repræsentative resultater, der genereres fra det. Protokollen beskrevet her ville være en værdifuld platform for hurtig, specifikke, følsomme og høj overførselshastighed screening af Salmonella spp. /Shigella spp.
Diarré er stadig en fælles spørgsmål om sundhed med en høj incidens Vurder globalt1,2. Selvom dødeligheden er relativt lav, nogle patienter viser forskellige symptomer for uger (f.eks. løs og vandig afføring, en hastesag at gå på toilettet), hvilket gør den socioøkonomiske indvirkning meget høj3,4. Mere alvorligt, nogle patienter kan selv udvikle irritabel tyktarm, hvis venstre ubehandlet5. Der findes mange forskellige slags bakterier, virus og parasitter, der kan forårsage diarré6. Salmonella spp. /Shigella spp. er blandt de mest almindelige bakterier til transmission af akut gastroenteritis7,8,9,10,11. Derfor, mange amter har udstedt love eller regler for regelmæssig Salmonella spp. /Shigella spp. screening blandt mennesker, der vil håndtere mad og vand. For eksempel, den kinesiske regering har udstedt love for obligatorisk Salmonella spp. /Shigella spp. screening en gang om året.
Metoden guldstandarden for Salmonella spp. /Shigella spp. opdagelse er bakterier kultur. Gennem bakterier kultur og successive biokemiske identifikation og serologiske karakterisering, kan vi identificere arterne af bakterier, som kan lette sygdom udbrud management og antimikrobiel profilering for at støtte til behandling af patienter 12. det kan også hjælpe med at spore kilden til infektionen i løbet af Salmonella spp. /Shigella spp. udbrud13. Men denne metode er arbejdskrævende (kræver manuel betjening) og tidskrævende (tage flere dage), især for test af et stort antal prøver7. Derudover levedygtige men ikke-bestemmelse (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kan findes i nogle afføringsprøver14. I betragtning af disse ulemper, mange laboratorier har forsøgt at udvikle nye teknikker til påvisning af Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. alle disse metoder bruger nukleare syre forstærkning test (NAAT), blandt hvilke Polymerasekædereaktionen (PCR) er den mest almindelige. En stor begrænsning af disse NAAT baseret metoder er, at døde bakterier, selv bakteriel snavs indeholder ufuldstændige genomisk DNA, kunne vise positive resultater26, som i vid udstrækning kunne påvirke de præcis diagnose af sygdommen. Blanco et al. viste, at Molekylær analyse er meget følsomme, ikke kun til levedygtige Salmonella i kulturer, men også til delvis genomer og døde eller ikke-levedygtige bakterier fra tidligere infektioner eller kontaminering26. Derfor bør der udvikles ny teknologi.
Her, beskrev vi en roman metode at kombinerer NAAT baseret metode og dyrkning. Som vist i figur 1, denne nye metode gælder real-time PCR screening først og derefter positive prøver sendes til bakterier kultur og identifikation.
Siden Salmonella spp. /Shigella spp. er ofte forbundet med madforgiftning og fækal-oral transmission af akut gastroenteritis28,29 og rutinemetoden er enten arbejdskrævende eller tidskrævende 7, vi beskriver en høj overførselshastighed platform for Salmonella spp. /Shigella spp. screening, ved hjælp af real-time PCR kombineret med guidet kultur.
Der er flere trin, der har…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af videnskab og teknologi Program af Zhuhai, Kina (grant nummer 20171009E030064), videnskab og teknologi Program af Guangdong, Kina (grant nummer 2015A020211004) og videnskab og teknologi Program af General Administration for kvalitetsovervågning, inspektion og karantæne i Folkerepublikken Kina (grant nummer 2016IK302, 2017IK224).
Tris | Sigma | 10708976001 | |
EDTA | Sigma | 798681 | |
NP40 | Sigma | 11332473001 | |
ddH2O | Takara | 9012 | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
XLD | LandBridge | CM219 | |
MAC | LandBridge | CM908 | |
Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
slide | Mingsheng | 7102 | |
micro-loop | Weierkang | W511 | |
incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
autoclave | AUL | SS-325 | |
dry bath | Jinghong | KB-20 | |
automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |