Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.
En los últimos años, microscopía de fuerza atómica (AFM) basado en espectroscopia de fuerza sola molécula (SMF) ampliada nuestra comprensión de las propiedades moleculares y funciones. Nos dio la oportunidad de explorar una multiplicidad de mecanismos biofísicos, por ejemplo, cómo bacteriana adhesinas atar a receptores de superficie de host más detalladamente. Entre otros factores, el éxito de los experimentos de SMF depende la inmovilización funcional y nativa de las biomoléculas de interés sobre las superficies sólidas y puntas de AFM. Aquí, describimos un protocolo sencillo para el acoplamiento covalente de las proteínas a las superficies de silicio utilizando silano-PEG-carboxyls y la química de N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) establecida en orden para explorar la interacción de la adhesina de pilus-1 RrgA la bacteria grampositiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) con la matriz extracelular proteína fibronectina (Fn). Nuestros resultados muestran que la funcionalización superficial conduce a una distribución homogénea de la Fn en la superficie de vidrio y a una concentración adecuada de RrgA en la punta del voladizo AFM, evidente por el valor objetivo de hasta un 20% de los eventos de interacción en SMF mediciones y reveló que RrgA se une a Fn con una fuerza media de 52 pN. El protocolo puede ajustarse a la pareja a través de sitio específico libre grupos tiol. Esto resulta en una orientación predefinida de proteína o molécula y es adecuado para otras aplicaciones biofísicas además las SMF.
Al lado de pinzas ópticas y magnéticas, la fuerza atómica (AFM) de microscopio1,2 ha surgido como una herramienta útil para analizar y manipular moléculas y probe sus propiedades y funciones, incluyendo su respuesta a la fuerza externa3 ,4. En cambio métodos como el enzima del inmunosorbente enlazado ensayo (ELISA), superficie de resonancia de plasmon (SPR) o cristal de cuarzo las configuraciones de microbalanza (QCM), AFM permite medir las interacciones a nivel de célula única (FCE)6 y sola molécula (SMF)5 . Estas tecnologías dado información valiosa sobre mecanismos vinculantes como los bonos de captura para la interacción de e. coli proteína pilus que fimh con manosa7, o el tándem β-cremallera repite formada por proteínas de unión de Fn de S. aureus en enlace a Fn8. Recientemente pudimos demostrar que la adhesina de pilus-19,10 de la bacteria grampositiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 es capaz de unirse a fibronectina12 RrgA con sus dos dominios terminales. Esto reveló un nuevo mecanismo de unión de dos dominios que difiere el tándem β-cremallera y puede permitir que los neumococos piliated formar y mantener un host contacto que contiene fibronectina transitoria superficies13.
El éxito de los experimentos de SMF depende críticamente de la inmovilización funcional y nativa de las biomoléculas en las superficies sólidas y puntas de AFM. Como las fuerzas altas pueden ocurrir durante las mediciones de la SMF, las proteínas deben preferiblemente covalente acoplarse a la superficie. Hay un gran número de métodos de acoplamiento para la inmovilización de proteínas y otras biomoléculas, así como células enteras en superficies sólidas (inorgánicas), nano-partículas y aparatos descritos en la literatura14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Estos protocolos suelen hacen uso de sustancias peligrosas, son difíciles de realizar y requieren de equipo especial (por ejemplo, limpiador de plasma). Una manera simple de moléculas de pareja al vidrio es adjuntar una capa más gruesa del polímero de heterobifunctional reticulados con un grupo silano reactivo en un lado y un grupo amina reactiva en su otro lado. Dependiendo de la aplicación, pueden constar de los agentes de acoplamiento flexibles hidrocarburo cadenas de longitud variable, por ejemplo., polietilenglicol (PEG). Suprimir las interacciones no específicas de las superficies modificadas (por ejemplo, hidrofóbicas, electrostáticas e interacciones de van-der-Waals) y puede proporcionar la libertad rotacional de la molécula acoplada.
Aquí, describimos un protocolo general para el acoplamiento covalente de las proteínas que contienen uno o más grupos amino libres (-NH2) superficies de vidrio y puntas de nitruro de silicio AFM vía un heterobifunctional etoxi silano-PEG-carboxilo (-COOH). Este protocolo se puede utilizar en experimentos de SMF, que ejemplo es basados en la interacción de la proteína de matriz extracelular Fn y RrgA (ver figura 1 para un resumen).
El primer paso es la silanización de la superficie28,29,30,31. Consiste en la hidrólisis de los grupos etoxi del agente de acoplamiento para formar grupos de SiOH altamente reactivos. Estos pueden reaccionar con los grupos de SiOH sobre el sustrato. En una condensación primaria paso, estos enlaces de hidrógeno de forma silanoles y difunda en el sustrato. En una reacción de condensación secundario (que requiere generalmente calor o vacío para eliminar el agua), se forman enlaces siloxano. Esto resulta en una capa de silano de organo covalentemente unido.
El segundo paso es el acoplamiento de las proteínas a la funcional (-COOH) grupos que se extienden desde el polímero32. En primer lugar, se convierte el ácido en un éster N-hydroxysuccinimid (NHS) reactivo intermedio, que es adquirido a través de la NHS/EDC bien establecida (1-etil – 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimid química33 y se somete a sustitución nucleofílica para finalmente formar un enlace amida con aminas primarias de las proteínas.
De esta manera, RrgA fue junto a puntas de AFM de nitruro de silicio y humano Fn a substratos de vidrio en una orientación al azar y se analizaron sus fuerzas de interacción en el nivel de molécula única. Nuestros resultados demuestran que la química superficial descrita conduce a una distribución homogénea de la Fn en la superficie de vidrio y a una concentración adecuada de RrgA en la punta, evidente por el valor objetivo de un 20% de los eventos de interacción durante las mediciones de SMF. Esta química reduce las interacciones de fondo no específica, está sujeto a poca alteración durante la adquisición de datos y por lo tanto ideal para experimentos precisos de SMF.
Desde la introducción del AFM basado en SMF, convertido en una técnica ampliamente utilizada para directamente sonda intra e intermoleculares fuerzas de proteínas individuales, ácidos nucleicos y otras biomoléculas3,4,5. Exitosos experimentos de SMF, una superficie apropiada estrategia de acoplamiento es un requisito previo. A prueba las fuerzas intramoleculares en polímeros naturales y sintéticos, los polímeros pueden acoplarse directamente a la superficie del sustrato y AFM punta36,38,39,40,41. Para la investigación de interacciones inter moleculares, tales como enlaces moleculares, sin embargo, es recomendable utilizar moléculas linker flexible como hetero-bifuncional enlazadores de PEG, o cadenas polipeptídicas, para unir a los socios de la interacción a la extremidad AFM y la superficie del sustrato, para permitir la correcta orientación de los socios de la Unión, para superar las fuerzas superficiales de corto alcance y para evitar la desnaturalización y desdoblamiento de las proteínas21,22,23, 24,25,26,27,42. Por lo tanto, nos describe un protocolo simple y sencillo para la inmovilización covalente de las proteínas a través de sus aminas primarias accesibles utilizando a espaciadores PEG hetero-bifuncional.
Hemos demostrado su aplicabilidad en la investigación de la interacción fuerzas entre la adhesina de RrgA de S. pneumoniae y la proteína de matriz extracelular Fn, como recientemente descrito en detalle en otra parte13.
La química superficial está bien establecida y enfoques analizados y similares se han utilizado con éxito en múltiples funciones experimentos19,42,43,44,45. El silylether utilizado para el acoplamiento con el polímero de silano a la superficie, está sujeto a hidrólisis. El grado de hidrólisis depende de la cantidad de bonos de siloxano formado, que pueden ser controlados durante el proceso de silanización. Si las fuerzas de interacción alto (≥ 1000 pN) se espera que durante las mediciones de la SMF, la silanización debe ser realizada a través de fase de vapor deposición30 que resulta en la formación de una capa continua de siloxanos. En cuanto a muchos experimentos (por ejemplo, muchas proteínas – las interacciones entre proteínas), las fuerzas de interacción están en el rango de unos cientos pN y el procedimiento descrito, en que siloxano formación se realiza por la deposición de una fase acuosa y desatada Organo-silanos son cuidadosamente lavada con etanol (paso 1.1.7) seguido por el curado con calor (paso de 1.1.8), es suficientes.
Otro paso importante es lavar la EDC restantes y moléculas NHS fuera de la superficie (paso 1.2.3), como sobras dará lugar a la activación de grupos carboxilo de las proteínas. Esto puede cualquier resultado en la reticulación de proteínas en la misma superficie, que pueden alterar su funcionalidad o covalente pareja activa proteínas a otras proteínas en la superficie opuesta. Esto puede conducir a la fijación de las proteínas entre la superficie y la punta AFM, que se traduce en fuerzas de ruptura alta posiblemente acompañadas por el despliegue de dominio (ver figura 3b, rastro 1, 4 y 5, despliegue de dominios Fn)46. Puede ocurrir el mismo problema, si los activos ésteres de NHS del espaciador PEG quedan insaturados. Por lo tanto, la incubación con solución salina tamponada con Tris se recomienda (paso 1.2.6), como la amina primaria de Tris sacia los aminos grupos reactivos restantes.
Siguiendo el protocolo paso a paso conduce a una distribución homogénea de Fn en el vidrio silanizada de la superficie (ver figura 2), dejando una forma dimérica de la proteína. Esto se asemeja a la estructura de Fn´s en solución y es consistente con los datos anteriores AFM en otros muestra superficies37. Además, se obtiene una concentración adecuada de RrgA en la punta AFM, que genera un valor objetivo de ~ 20% de los eventos de interacción bien definida durante las mediciones de SMF (figura 3 y figura 4). Otra forma elegante de controlar la cantidad de moléculas junto a la punta del sustrato y voladizo de muestra además variando los tiempos de la concentración o incubación de la proteína, es la combinación de silano-agentes con diferentes grupos funcionales secundarios. Cambiando la relación de grupos reactivos de la proteína que se extiende desde los polímeros de PEG, el número de proteínas inmovilizadas puede ser controlados15,16,17,18.
El protocolo descrito aquí puede también utilizarse para inmovilizar otras moléculas que contienen -NH2 o ajustarse a las proteínas par a otra superficie de óxido de silicio además de nitruro de silicio y vidrio. Dependiendo del diseño de la proteína, el grupo carboxyl reactivos de Amina se puede cambiar a un grupo reactivo sulfhidrilo (p. ej., maleimida o ortho-piridil disulfuro) para acoplar la proteína a través de su libre – grupos SH. Para Fn, esto resulta en una orientación predefinida13,17,20.
En Resumen, este protocolo puede ajustarse para atender a diferentes requerimientos y es adecuado para otras aplicaciones biofísicas además de experimentos de espectroscopia de fuerza sola molécula.
The authors have nothing to disclose.
TB y HG reconocen apoyo financiero a través del Consejo Europeo de investigación “Cellufuel, avanzado beca Nº 294438”. HCS reconoce el apoyo financiero del Ministerio Federal de educación e investigación a través de la proteína de Technofunktionale de Innovationsallianz (TeFuProt), SS reconoce financiera apoyo del ministerio bávaro de estado de educación y ciencia mediante el enfoque de la investigación “Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe – CANTER”. Agradecemos a Conny Hasselberg-Christoph y Martina Hörig para soporte técnico
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |