לכימות הצמח חלבון מסיס והתוכן לעיכול פחמימות, באמצעות תירס (זיה מייז) כמו שיוצרו
Summary
הפרוטוקולים המפורטים להלן מספקים מתודולוגיה ברור ונגיש למדידת חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות (שאינן מבניות) ברקמות הצמח. היכולת לכמת macronutrients צמח שני אלה יש השלכות משמעותיות לקידום השדות של פיזיולוגיה של הצמח, אקולוגיה תזונתי, אינטראקציות צמח-הרביוור ואקולוגיה מזון-web.
Abstract
נתונים היסודות משמשים להסיק איכות הצמח כמשאב עבור אוכלי עשב. עם זאת, את הנוכחות המתמדת של הפחמן של מולקולות, הנוכחות של צמחים המכילים חנקן הגנתית תרכובות, וריאציה תלויי מין מתאמים בין חנקן וצמח תכולת החלבון כל להגביל את הדיוק של מסקנות אלה. בנוסף, המחקר התמקד צמח ו/או פיזיולוגיה הרביוור דורשים רמת הדיוק לא מושגת באמצעות מוכללת מתאמים. השיטות המובאות כאן מציעים החוקרים פרוטוקול ברור ומהיר למדידת ישירות חלבונים מסיסים צמח ופחמימות לעיכול, macronutrients צמח שני קשור קשר הדוק ביותר בביצועים פיזיולוגיים בעלי חיים. הפרוטוקולים לשלב מבחני ערכי צבע מוחלטים טוב מאופיין בצעדים עיכול צמחים ספציפיים ממוטבת כדי לספק תוצאות לשחזור ומדויק. שלנו ניתוחים של תירס מתוק שונה רקמות להראות שיש אלה מבחני הרגישות כדי לזהות את הוריאציה הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות מעבר סולמות המרחבי מרובים. אלה כוללים את ההבדלים בין-צמח על פני גדל אזורים ו מינים או סוגים שונים, כמו גם בתוך מפעל-הבדלים בסוג הרקמה והבדלים אפילו לפי מיקום בתוך רקמת אותו. שילוב של חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות עם נתונים אלמנטלים יש גם פוטנציאל לספק הזדמנויות חדשות בביולוגיה צמח להתחבר תזונה מינרלים צמח צמחים תהליכים פיזיולוגיים. ניתוחים אלה גם לעזור ליצור את חלבון מסיס והנתונים לעיכול פחמימות צריך ללמוד אקולוגיה תזונתי, אינטראקציות צמח-herbivore ו מזון-web דינמיקה, אשר בתורו יהיה לשפר פיזיולוגיה ומחקר אקולוגי.
Introduction
צמח ביומסה צורות היסוד של כמעט כל במארג המזון הארצי. צמחים לרכוש רכיבים תזונתיים מן הקרקע באמצעות מערכות השורשים שלהם, לנצל את אור השמש ברקמות בריסוס שלהם לסנתז מולקולות. בפרט, פחמן וחנקן משמשים כדי ליצור פחמימות, חלבונים (המורכב של חומצות אמינו), וכן שומנים הדרושות כדי לבנות מפעל ביומסה (יצוין כי בתוך הצמח פיזיולוגיה שהמונח “חומר מזין” מתייחס לעתים קרובות רכיבי הקרקע, כגון N, P, K, ו- S, עם זאת, לאורך כל המאמר מונח זה מתייחסים מולקולות, כגון חלבונים, פחמימות ושומנים). כאשר אוכלי עשב צורכים חומר צמחי, macronutrients הכיל ברקמות הצמח מחולקים שלהם החלקים המרכיבים אותה הינם ואז נהגת לשגע את התהליכים הפיזיולוגיים של הצרכן. בדרך זו, צמח macronutrients יש השפעה חזקה על הצרכן פיזיולוגיה יחד עם השלכות חשובות על סדר גבוהה יותר אינטראקציות אקולוגית, יחסי מזון-web.
ברחבי ממלכת החי, חלבון מסיס ופחמימות לעיכול הם macronutrients קשור קשר הדוק ביותר הישרדות, רבייה וביצועים1. יתר על כן, הרוב המכריע של בעלי חיים פעיל לווסת את צריכת אלה macronutrients שני להכיר את הדרישות הפיזיולוגיות1,2. זה נכון במיוחד עבור אוכלי חרקים המאתרות את ריכוזי סוכר וחומצות אמינו ברקמות הצמח, אשר בתורו מנחה את התנהגות האכילה. כתוצאה מכך, הצמח חלבון מסיס, תוכן לעיכול פחמימות מילא תפקיד חזק באבולוציה של אינטראקציות צמח-חרקים.
בעוד נתונים על הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות הם נדירים יחסית (אך ראה6,7,8,9,10,11), אין שנגדו נתונים זמינים על הצמח תוכן אלמנטלים (פחמן, חנקן, זרחן). במידה רבה זה כי אלמנטים לשחק תפקיד ראשי מפעל הזנה מינרלית3,4,5. אלמנטים נמדדים, מתאמים שימשו כדי לנחש את כמות חלבונים מסיסים, לעיכול פחמימות, אבל חישובים מדויקים לעיתים קשה להשיג. למשל, זה בלתי אפשרי להשתמש פחמן כמחוון של הצמח לעיכול פחמימות תוכן כי פחמן נמצא ubiquitously כל תרכובות אורגניות. מערכת יחסים חזקה קיים בין היסודות חנקן ותוכן חלבון מסיס צמח, פקטורים של המרה חנקן-כדי-חלבון כללית מנוצלים לעיתים קרובות. עם זאת, יש ראיות חזקות כי המרות חנקן-כדי-חלבון הם מאוד ספציפית12,13,14,15, שהופך את השימוש להפרעת המרה סביר אתה לא חייב. מסיבה זו, פקטורים של המרה חנקן-כדי-חלבון לעתים קרובות חוסר דיוק, במיוחד במידה הנדרשת ללימודי תזונה על אוכלי עשב. כמו כן, הנוכחות של allelochemicals צמח המכיל N, כגון אלקלואידים, glucosinolates לעיתים קרובות רעילים אוכלי עשב, יכול וחיסול המרות אלה.
כאן, אנו מציעים שני מבחני כימי למדידת ריכוז חלבונים מסיסים ופחמימות לעיכול ברקמות הצמח. מבחני אלה מוצגים בנפרד, אבל הוא הציע כי הם לשמש במקביל כדי לנתח את הדגימות באותו צמח על מנת להשיג ניתוח מקיף יותר של macronutrients הצמח. שניהם מעסיקים מתודולוגיות דומה, המורכב צעד החילוץ, ואחריו כימות דרך ספיגת. צמח מדגם הכנה גם הוא זהה עבור פרוטוקולים, ולכן קל לפעול בשני ניתוחים במשולב. השירות של מבחני אלה אינה נובעת החידוש שלהם, כפי שהם מסתמכים על בוגרים, (ברדפורד, ג’ונס, דובואה) מבחני ערכי צבע מוחלטים ומבוססת16,17,18, אבל כאן. ארגנו כמובן, easy-to-בצע פרוטוקול שמשלב שיטות אלה יותר מעורפלים מיצוי צמחים ספציפיים טכניקות17,19 על מנת להפוך את היישום של מבחני אלה נגיש יותר לאלה בתחומים הרלוונטיים-צמח.
עבור שני מבחני, צמח macronutrients קודם מחולצים פיזית על ידי הקפאה, lyophilizing, שחיקה של חומר צמחי. עבור וזמינותו חלבון מסיס, בהמשך החילוץ כימי נעשה17,19 דרך כמה סיבובים של vortexing וחימום דגימות תמיסת NaOH. וזמינותו ברדפורד ידועים, ניצול Coomassie G-250 כחול מבריק, משמש לאחר מכן לכמת חלבונים מסיסים ו polypeptides בין 3,000-5,000 Daltons16,17. Assay הזה יש מגוון זיהוי בין 1-20 חלבונים הכולל µg לכל microplate טוב או < µg 25/mL, אך האם לא מדד חינם חומצות אמינו. השלב החילוץ של וזמינותו לעיכול פחמימות מבוססת על שיטת חומצה שתדללו סמית. et al. 20 ומאפשר ניתוקה של סוכרים מסיסים, עמילן, ו fructosan – אבל מבנית לא פחמימות. שיטה כימות חומצה גופרתית-פנול נלקח דובואה. et al. 18 מודד כל מונו-, oligo-, סוכרים (וכן מתיל נגזרים). זה וזמינותו היא היכולת לכמת סוכרים מסוימים, אבל כאן אנחנו משתמשים בו כמחוון של תוכן הכולל לעיכול פחמימות (ראה סמית. et al. 20 לניתוח מפורט יותר). יחד, אלה מבחני למדוד את macronutrients שני ו”לעזור חריפה לשתול eco-פיזיולוגיה וביצועי הרביוור, ומספקת נתונים חשובים על איכות המשאב בבסיס במארג המזון הארצי. הצגת פרוטוקולים אלה מקדמת את הדור של הצמח חומר מזין נתונים (datasets) על מנת לקבל הבנה מעמיקה יותר של פיזיולוגיה של הצמח, אקולוגיה תזונתי הרביוור אינטראקציות צמח-הרביוור.
Protocol
Representative Results
Discussion
על ידי שילוב מבחני ערכי צבע מוחלטים ומבוססת עם מיצוי הצמח ספציפי יעיל פרוטוקולים, מבחני המודגמות כאן מספקות שיטה הגיונית ומדויק למדידת הצמח חלבון מסיס ותוכן לעיכול פחמימות. התוצאות שלנו באמצעות תירס כפי דוגמה מאליזבת מדגים כיצד ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה כדי לקבל מידות מדויקות מעבר סול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה לכל השותפים שלנו, מי שעזרו עם אוספים שדה תירס מתוק, כולל דומיניק Reisig מוט דן-צפון קרוליינה סטייט, ואת פאט פורטר-טקסס A & M באוניברסיטת, אילת. תודה ל clissold ב פיונה שעזרת כדי למטב את הפרוטוקולים ולסיפוק עריכות כתב היד הזה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי טקסס A & M ג Everette Salyer אחוות (המחלקה לאנטומולוגיה) והתוכנית ביוטכנולוגיה הסיכון הערכת מענק תחרותי מענק מס 2015-33522-24099 של מחלקת החקלאות של ארצות הברית (מוענק גז, STB).
Materials
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
References
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. . The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. . Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. , (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. . Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
