Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

Con attuali progressi in medicina, l’aspettativa di vita è aumentata in modo significativo; Tuttavia, così ha la prevalenza delle malattie età-correlate. Malattie del sistema nervoso centrale (CNS) come schizofrenia, sclerosi laterale amiotrofica (ALS), morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson, tra gli altri, non fanno eccezione e sono stati progettati per aumentare sopra il prossimo decennio^{1, 2 , 3}. il malfunzionamento del noto come recettori N-metil-D-aspartato (NMDAR) dei recettori ionotropi del glutammato è stato collegato al morbo di Alzheimer, schizofrenia, trauma cranico, ictus, diabete e glaucoma tra gli altri, che garantisce la bisogno di studiare la loro biologia per lo sviluppo di terapie efficaci, modificante la malattia^4,5,6,7.

NMDARs sono composti da quattro monomeri o subunità^4,8,9. La composizione strutturale della NMDAR Mostra variabilità inerente allo sviluppo e regionali entro il cervello^7,10. NMDARs sono coinvolti nella plasticità sinaptica, cognizione e la generazione dei ritmi per respirazione e locomozione^11,12,13. Come un canale voltaggio-dipendente, è in gran parte non conduttore al potenziale di membrana a riposo (-70 mV) e viene bloccato da magnesio per prevenire ulteriori permeazione degli ioni. Il canale è attivato dall’associazione di due ligandi, glutammato e glicina/D-serina, e una depolarizzazione simultanea alla membrana sinaptica mediata da recettori AMPA, un’altra sottoclasse di recettori ionotropici del glutammato. La depolarizzazione rimuove il blocco di magnesio di NMDAR, consentendo l’afflusso dei cationi, in particolare calcio^14,15,16. Anche se l’attivazione di NMDAR è essenziale per la sopravvivenza delle cellule, attivazione eccessiva può portare a cellule morte^17,18,19 attraverso excitotoxicity. Questo, oltre la complessa natura del recettore, rende difficile effettuare studi necessari per lo sviluppo di terapie efficaci.

Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la NMDAR. Tuttavia, ciascuno di essi è corredato da avvertimenti. Ad esempio, una tecnica ampiamente utilizzata è un’analisi di fluorescenza-basata che misura i cambiamenti di NMDAR-mediati in calcio intracellulare in una linea cellulare stabile sotto il controllo di un promotore inducibile tetraciclina (Tet-On)²⁰. Tuttavia, in questo sistema, le concentrazioni di sopramassimale di ligandi che sono necessari e l’obbligo che gli inibitori di NMDAR sono presenti durante la misurazione rende quasi impossibile rilevare l’attività dell’antagonista competitivo. In altri sistemi simili, l’espressione del recettore funzionale provoca tossicità, che richiedono di bloccanti dei canali come ketamina^21,22 per preservare le colture cellulari. Questi antagonisti sedersi al centro del recettore e sono difficili da lavare fuori, soprattutto in un formato basato su piastra, in modo da interferire con gli studi funzionali del recettore. Infine, nelle misurazioni elettrofisiologiche come patch di bloccaggio, c’è la velocità effettiva limitata e studi su larga scala sono molto costosi²³. Nonostante, i sistemi di cui sopra sono insensibili alla stimolazione di glicina; quindi, studiando attività di glicina-dipendente del NMDAR diventa una sfida.

Qui, descriviamo un nuovo approccio per lo studio di NMDAR che supera le limitazioni discusse. La nostra tecnica sfrutta il sistema di espressione di baculovirus per esprimere il recettore a livello funzionale con un rapporto ottimale delle subunità in meno di 16 ore. Inoltre, l’uso di baculovirus consente un approccio semplice e combinatorio, che fornisce un’ampia caratterizzazione dei sottotipi distinti ricombinante NMDAR. A differenza di altri saggi, questo protocollo non richiede bloccanti dei canali a causa dell’uso di antagonisti deboli. Vantaggio più forte del metodo è quello dopo interruzione dell’antagonista debole, il recettore è sensibile alla modulazione dei siti individuali della glicina e del glutammato-associazione oltre a doppia modulazione di glutammato e glicina/D-serina ligand-legantesi siti. Il dosaggio ricapitola noto farmacologia del recettore NMDAR e gli effetti dei suoi noti modulatori positivi e negativi. Infine, generazione di questo test in vitro cellular supera la tossicità cellulare causata da afflusso del calcio eccessivo e permette per studi funzionali del recettore in un modo ad alta velocità, che può accelerare le scoperte dei modulatori NMDAR negli Stati di malattia.