Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.
Abstract
La coltura di Caenorhabditis elegans (c. elegans) in maniera su larga scala su piastre di agar possa essere che richiede tempo e difficile. Questo protocollo descrive un metodo semplice e poco costoso per ottenere un gran numero di animali per l’isolamento delle proteine di procedere con ulteriori analisi proteomica, spettrometria di massa o un western blot. Inoltre, un aumento dei numeri del nematode per immunostainings e l’integrazione delle analisi multiple sotto le stesse condizioni di coltura può essere raggiunto facilmente. Inoltre, un trasferimento tra piastre con differenti condizioni sperimentali è facilitato. Tecniche comuni nella cultura piastra coinvolgono il trasferimento di un singolo c. elegans utilizzando un filo di platino e il trasferimento di agar popolate pezzi usando un bisturi. Tuttavia, con l’aumento del nematode numeri, queste tecniche diventano eccessivamente lunghe. Questo protocollo descrive la coltura su grande scala di c. elegans compresi i numerosi passaggi per ridurre al minimo l’impatto della preparazione del campione sulla fisiologia del worm. Fluido e shear stress può modificare la durata di vita e processi metabolici in c. elegans, richiedendo così una descrizione dettagliata delle fasi critiche al fine di recuperare risultati affidabili e riproducibili. C. elegans è un organismo modello, costituito da cellule di un neurone per fino a un terzo, ma in mancanza di vasi sanguigni, fornendo così la possibilità di indagare esclusivamente alterazioni neuronali indipendente di controllo vascolare. Recentemente, neurodegenerazione precoce nella retinopatia diabetica è stata trovata prima di alterazioni vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Ad esempio, una formazione aumentata di glycation prodotti finiti avanzati (età) e specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono osservata, che si trovano in modo riproducibile in c. elegans. Protocolli di gestire campioni di dimensioni adeguate per uno spettro più ampio di indagini sono presentati qui, esemplificato dallo studio delle alterazioni biochimiche indotte da diabete. In generale, questo protocollo può essere utile per gli studi che richiedono grande c. elegans numeri e nella quale coltura liquida non è adatta.
Introduction
Analisi di proteine, come una macchia occidentale o spettrometria di massa, richiedono milligrammi di proteine. Questo rendimento richiede una coltura su grande scala delle centinaia di c. elegans, che possono essere compiute in coltura liquida o in terreni solidi trasferendo i nematodi mediante lavaggio. Fluido e shear stress induce l’espressione di canali epiteliale del sodio (ENaC), che potrebbe aumentare lo stress osmotico attraverso un maggiore assorbimento di sodio, potenzialmente alterare la durata della vita di c. elegans e che interessano analisi metaboliche1 . Di conseguenza, alcuni passaggi critici nel presente protocollo per l’approccio basato su piastra prendere la riduzione dello stress che colpiscono la variabilità sperimentale in considerazione. Coltura liquida, d’altra parte, influenza il fenotipo dei nematodi e complica la cultura e la raccolta di un numero esatto di nematodi2. Inoltre, sostanze reattive possono essere modificate da componenti multimediali e possono essere distribuito in modo non uniforme prima di raggiungere i nematodi. Per quanto riguarda le limitazioni della coltura liquida, questo protocollo fornisce un approccio alternativo alla coltura campioni su larga scala di c. elegans.
C. elegans è un organismo di modello con una rete distinto di cellule neuronali 302, che costituiscono un terzo di tutte le sue cellule3. Sin dalla sua introduzione in scienza, molti omologhi e geni ortologhi sono state descritte, amplificando il suo valore come un modello per la ricerca medica. Recentemente, la prova per danno neurologico nella retinopatia diabetica, prima del danno vascolare, è stata presentata4. C. elegans è privo di vasi sanguigni, ma contiene una rete neuronale distinta, che lo rende un modello adatto per studiare alterazioni neuronali a parte quelle vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Le alterazioni biochimiche nelle complicazioni diabetiche comportano la formazione di età, che influenzano ulteriormente la formazione di ROS in risposta all’iperglicemia5. Età si trovano in c. elegans e contribuire al danno neuronale6. Malattie croniche sono spesso causate da processi complessi, poligenici che richiedono un approccio multiparametrico per la valutazione dei loro meccanismi di fondo, come esemplificato qui con la valutazione delle complicazioni diabetiche. Questo protocollo può essere utile per ottenere più parametri simultaneamente, così come successivamente. Una maggiore comparabilità e riproducibilità di un approccio multiparametrico si ottengono omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta un metodo affidabile per la coltura su grande scala di c. elegans per ottenere risultati quantitativi. I risultati dalla letteratura possono essere replicati come mostrato nei Risultati di rappresentante. Anche se questo protocollo per la raccolta di campioni su larga scala di c. elegans sembra un metodo semplice, ci sono certe insidie di prendere in considerazione. Per quanto riguarda la sincronizzazione della popolazione del nematode, questo protocollo descr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) entro il 1874 IRTG “Complicazioni microvascolari diabetiche” e CRC 1118 “Metaboliti reattivi come causa per le complicazioni diabetiche tarda”. Ceppi di c. elegans N2 e CL2166 sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall’ufficio NIH di programmi di ricerca dell’infrastruttura (P40 OD010440).
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
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