تصور المتغيرات الجينية وأهداف قصيرة والطفرات في سياق الأنسجة المورفولوجية الجيش النيبالي الملكي في الموقع تهجين المقايسة
Summary
هنا، يمكننا وصف في الموقع تهجين الإنزيم الذي تمكن من كشف حساسة ومحددة لمتواليات قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 مع قرار واحد-النوكليوتيدات على مستوى خلية واحدة. المقايسة، التي يمكن أن يؤديها يدوياً أو تلقائياً، يمكنك تمكين التصور المتغيرات لصق ومتواليات قصيرة، والطفرات في سياق النسيج.
Abstract
نظراً لدقة الطب اعتماداً كبيرا على كشف دقيق للمؤشرات الحيوية، وهناك حاجة متزايدة لتكنولوجيات موحدة وقوية بقياس الحمض النووي الريبي المؤشرات الحيوية في الموقع في العينات السريرية. بينما فحوصات طحن وربط مثل رناسيق وتمكين RT-PCR الكمي القياسات التعبير الجيني حساسة للغاية، أنها تتطلب أيضا استخراج الحمض النووي الريبي ومما يحول دون تحليل قيمة التعبير في سياق النسيج المورفولوجية. في الموقع التهجين (العش) مقايسة الموصوفة هنا يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي الهدف تسلسل قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 في قرار واحد-النوكليوتيدات، وعلى مستوى خلية واحدة. هذا الفحص مكمل للمقايسة التجارية المتقدمة سابقا وتمكن من كشف حساسة ومحددة في الموقع المتغيرات لصق وأهداف قصيرة والطفرات نقطة داخل الأنسجة. صممت تحقيقات في هذا البروتوكول، لاستهداف تقاطعات إكسون فريدة من نوعها للخيارين لصق المهمة سريرياً، اجفرفيي و METΔ14. وتجلى في الكشف عن تسلسل الهدف القصير كشف تسلسل CDR3 من خلايا تي مستقبلات α و β في خط جوركات تي خلية محددة. كما هو موضح من فائدة هذا الإنزيم العش لتمييز تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدف في قرار واحد-النوكليوتيدات (الطفرات) من خلال تصور تباينات واحد-النوكليوتيدات EGFR L858R و G12A كراس في خطوط الخلايا باستخدام التلوين الآلي الأنظمة الأساسية. وخلاصة القول، يظهر البروتوكول فحص العش الحمض النووي الريبي متخصصة التي تمكن من الكشف عن المتغيرات لصق متواليات قصيرة والطفرات في الموقع للأداء اليدوي والآلي ستينيرس.
Introduction
وتحسنت التكنولوجيات ترانسكريبتوميك الفائق مثل [ميكروارس] والجيل التالي تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) أضعافاً مضاعفة اكتشاف الحمض النووي الريبي المؤشرات الحيوية مع التشخيص وتنبؤاتها، وتوقع القيمة السريرية للأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان1،2. للنهوض باستخدام هذه المؤشرات الحيوية في الطب الدقة، هناك ارتفاع الحاجة إلى تكنولوجيات موحدة وقوية التي يمكن قياس المؤشرات الحيوية في الجيش الملكي النيبالي في سياق الأنسجة العينات السريرية. بينما أنشئت على نطاق واسع معبراً طحن وربط مثل رناسيق والكمية RT-PCR تمكين القياسات التعبير الجيني حساسة للغاية، بتجانس الأنسجة المطلوبة وعزل الحمض النووي الريبي يعني الخسارة في فيفو خصوصية نوع الخلية و معلومات الخصائص المورفولوجية3. التقليدية في الموقع الحمض النووي الريبي منهجيات الكشف تفتقر إلى الحساسية والنوعية المطلوبة لقياس المؤشرات الحيوية الحمض النووي الريبي نادرة أو التعبير عن منخفضة داخل سياق النسيج4موثوق بها.
فحص تهجين (العش) تجاري في الموقع (على سبيل المثال.، الإنزيم رناسكوبي) هو واحد من التكنولوجيا التي عالجت هذه التحديات ويتيح أيضا التصور حساسة للغاية ومحددة من جزيئات الحمض النووي الريبي واحد أكبر من 300 النيوكليوتيدات ضمن سياق المورفولوجية الأنسجة. يستخدم هذا النوع من التحليل تصميم مسبار اليغنوكليوتيد فريدة من نوعها تقريبا 6 – 20 مسبار مزدوج زي أزواج جنبا إلى جنب مع إشارة متقدمة المستندة إلى التهجين تضخيم5.
تصف هذه الدراسة مقايسة ايش الجيش الملكي النيبالي متخصصة، باسيسكوبي، مكملة للتكنولوجيا التجارية المصممة مسبقاً التي يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي الهدف تسلسل قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 في القرار النوكليوتيدات واحدة. هذا التحليل يتناول تعقيدات معقدة الترنسكربيتوم وقابلاً للكشف عن دقة تقاطعات إكسون وتسلسل الهدف القصير والطفرات في سياق النسيج (الجدول 1) استخدام أقل قدر من مسبار مزدوج زي زوج. هذا التقرير يوضح البروتوكول الفحص الكامل واستخدامها في الكشف عن المتغيرات لصق، تسلسل CDR3 لخلايا تي مستقبلات الحيوانات المستنسخة، والطفرات النوكليوتيدات واحدة في فب الخلية خطوط وورم الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي هذا التقرير، البروتوكول المقايسة ايش الرواية وتطبيقاتها، نوقشت بالتفصيل. يسمح المقايسة للتصور مباشرة من تقاطعات إكسون ومتواليات قصيرة-الهدف والغاية مثلى، والطفرات في سياق النسيج. المقايسة يستند إلى التكنولوجيا رناسكوبي5 وهو لذلك قادر على الكشف عن جزيء واحد. ومع ذلك، نظراً لنظام تضخيم متقدمة، الإشارة يمكن الكشف عن المسابير التي تحتوي على أقل من واحد مزدوج زي زوج أو مع طول قالب مستهدفة من النيوكليوتيدات 50 فقط. نظراً للتحقيقات قد تكون قصيرة بقدر مزدوج-Z واحدة في الطول، وهذا يسمح للكشف عن الوصلات إكسون ومتواليات قصيرة-الهدف والغاية مثلى، والطفرات (الجدول 1).
للحصول على الأداء الناجح للمقايسة، وهناك العديد من التوصيات التقنية. أولاً، ينبغي إصلاح الأنسجة في الطازجة مخزنة المحايد 10% فورمالين (NBF) في درجة حرارة الغرفة ل 16 – 32 ح10. أونديرفيكسيشن ( ح 32) سوف يضعف الأداء للمقايسة وقد تتطلب التحسين إضافية. ثانيا، لضمان التحكم الأمثل لدرجة الحرارة والرطوبة، ومطلوبة من أجل التضخيم التهجين وإشارة قوية التحقيق، ينبغي أن تستخدم الشريحة تجهيز الفرن النظام والتهجين لبروتوكول الخطوات 2، 3 إلى 5 (مبطلات مسبار المعالجة المسبقة، التهجين وتضخيم الإشارات والكشف عن إشارة). المخازن المؤقتة المتبقية الزائدة، والثالث ينبغي أن يكون وفوجازارو بشكل صحيح قبل كل خطوة في جميع أنحاء البروتوكول (ولكن ليس كثيرا حتى أن تجف أقسام الأنسجة). إذا كانت الشرائح تجف، ستضع كبيرة غير محددة إشارة. ورابعاً، تبعاً لنوع النسيج، المعالجة المسبقة الأمثل قد يكون ضروريا. استخدام حوزتي خاطئة أو أداء لطول الوقت الأمثل قد يؤدي في إطار-أو أكثر-digestion وستؤثر سلبا على الإشارة. وأخيراً، من المهم دائماً تشغيل عناصر إيجابية وسلبية مع تحقيقات الاختبار. ضمان تحقيقات الرقابة السلبية أن هناك أي إشارة خلفية، ومجسات مراقبة إيجابية تضمن أنه تم القيام الفحص بشكل صحيح وأن نوعية الجيش الملكي النيبالي في العينة الأمثل لتفسير نتائج التحقيق الاختبار. إذا لم يكن هناك لا إشارة مع المسبار مراقبة إيجابية، ثم نوعية الجيش الملكي النيبالي في العينة من المحتمل دون المستوى الأمثل، وقد لا تعتبر إشارة مع المسبار الاختبار.
بالإضافة إلى الفحص اليدوي، والقدرة على القيام التحليل على ستينيرس الآلي كان أيضا أظهر (الشكل 6). هذا الفحص الآلي ايش نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية الغلة وقابلاً للتطبيق للتطبيقات نفسها كما هو مبين في الجدول 1؛ بيد أن فوائد الفحص الآلي تشمل توحيد شروط المقايسة، التقليل من التباين بين المستخدم ووقت التدريب العملي، وبدل للفرز الفائق لعينات الأنسجة بطريقة موثوقة.
بينما تسمح إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) و qRT-PCR للكشف عن المتغيرات لصق (وبخاصة اجفرفيي)، في العينات السريرية فب، هذه التقنيات يمكن أن تفتقر إلى الدقة اللازمة ولا توفر نظرة ثاقبة القرار المكانية للوصلة تعبير متغير، على التوالي11،12. مزايا رئيسية للتحليل في هذا البروتوكول هو في التصور حساسة للغاية ومحددة من تقاطعات الوصلة مع الحفاظ على سياق الأنسجة المورفولوجية. هنا، كان الفحص القدرة على التحديد استهداف تقاطعات إكسون فريدة من نوعها لمتغيرات لصق عدة، بما في ذلك اجفرفيي و METΔ14، أظهر (الشكلان 3 و 6). وبالإضافة إلى ذلك، قد ثبت الفحص للكشف عن الخيار لصق ع-V7 في سرطان البروستاتا، isoforms متعددة من ErbB4 في المخ، وتأكيدا للضربة القاضية للتعميم Cdr1as الجيش الملكي النيبالي في الماوس الدماغ3،،من1314.
الهدف القصير تسلسل الكشف بواسطة هذا الإنزيم ايش يسمح بتصور لتسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة قدر النيوكليوتيدات 50 في الطول، كما يتضح من الكشف عن تسلسل CDR3 المستمدة من الخلايا جوركات (الشكل 3). الفحص يمكن أيضا الكشف عن تسلسل الجينات التي الغاية مثلى لأفراد الأسرة أو الأنواع الأخرى كما هو مبين من Revêchon et al.، الذين استخدموا المقايسة الهدف القصير للكشف عن progerin البشرية التي أعرب عنها في الأنسجة الدهنية البيضاء تحت الجلد الماوس15. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون الحمض النووي الريبي النوية الصغيرة (سنورنا)، وتحرير كريسبر بوساطة الجينات والسلائف-ميكرورنا المكتشفة في الموقع مع المقايسة الهدف القصير. في الآونة الأخيرة، مجتمعة فو et al. هذا الإنزيم العش مع المدينة لتحديد الخلايا الدقيقة في الشبكية معربا عن mir125b ميرنا قبل16.
الطفرة التنميط في أورام أمر بالغ الأهمية لدراسة تطور الأورام وتطوير العلاجات المستهدفة. بينما التنميط الطفرات يمكن أن يتحقق عن طريق التسلسل الفائق، هذه التكنولوجيا لا يمكن أن تتناول بالكامل intratumoral التعديلات الوراثية التغاير أو الارتباط مع مورفولوجيا الخلوية17،18. الكشف عن الطفرات باستخدام مقايسة ايش هذا يسمح بتمييز تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف بدقة قاعدة واحدة، كما تم التحقق من صحتها قبل الكشف عن الاختلافات النوكليوتيدات واحدة EGFR L858R و G12A كراس في خطوط الخلايا (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، تستخدم بيكر وآخرون المقايسة طفرة نقطة لاستهداف طفرات متعددة في المسرطنة براف وكراس و PIK3CA في سرطان القولون والمستقيم18. أنهم كانوا قادرين على تحديد ورسم خريطة مكانياً سوبكلونيس سلاحف نادرة من الخلايا السرطانية، وفي نهاية المطاف تبين كيف أنها تسهم في عدم التجانس داخل الورم.
وباختصار، وضعت فحص العش الحمض النووي الريبي متخصصة. تسمح هذه المنهجية للكشف عن المتغيرات لصق ومتواليات قصيرة والطفرات في الموقع. أنها حساسة ومحددة وقابلة للقياس وقابلة للتكيف للأداء بالأساليب اليدوية، وفي ستينيرس الآلي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
| HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
| ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
| HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| 100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
| Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
| Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
| BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
| BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
| BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
| BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
| BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
| BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
| BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |
References
- Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers. International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).
- Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer. Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
- Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2016)
- An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. , (2018).
- Frampton, G. M., et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).
- Awad, M. M., et al. MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression. Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).
- Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered. Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).
- Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma. Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).
- Zhu, Y., et al. Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer. European Urology. , (2017).
- Piwecka, M., et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. , (2017).
- Revêchon, G., et al. Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time. Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).
- Fu, Y., et al. Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats. Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).
- Yates, L. R., et al. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).
- Baker, A. M., et al. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).
