תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem
Summary
כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.
Abstract
מספר תרופות חדשות שזוהו על ידי מסורתית, מסכי במבחנה נחלשה, הפחתת ההצלחה של גישה זו בחיפוש אחר נשק חדש למאבק רב תרופתיים. זה הוביל למסקנה כי החוקרים אינם רק צורך למצוא תרופות חדשות, אבל גם צריך לפתח דרכים חדשות למצוא אותם. בין המועמד המבטיח ביותר שיטות הן כל-אורגניזם, ויוו assays המפרט את השימוש תפוקה גבוהה, פנוטיפי ומארח שנעים בטווח שבין Caenorhabditis elegans ל רזבורה rerio. מארחים אלה יש מספר יתרונות רב עוצמה, כולל הפחתה דרמטית כניסות חיובי כוזב, שחרורן תרכובות רעילים המארח ו/או biounavailable הם בדרך כלל במסך הראשוני, לפני בצע יקר למעלה.
הנה אנחנו מראים כיצד נעשה שימוש assay שלנו לחקור מארח את הוריאציה מתועדת היטב C. elegans—Pseudomonas aeruginosa הרג נוזלי pathosystem. אנחנו גם להוכיח מספר הרחבות של טכניקה זו הסתדר היטב. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע את מסכי גנטי תפוקה גבוהה באמצעות RNAi ב 24 – או 96-ובכן צלחת תבניות לגורמים מארח שאילתה באינטראקציה זה פתוגן-פונדקאי. שימוש assay הזה, מסכי הגנום כולו ניתן להשלים רק כמה חודשים, אשר יכול באופן דרמטי לפשט את המשימה של זיהוי מטרות סמים, שעשוי להיות ללא צורך גישות טיהור הביוכימי מפרך.
אנחנו גם מדווחים כאן וריאציה של השיטה שלנו, שמחליפה את חיידק גראם חיוביים Enterococcus faecalis עבור המחלה גראם שליליים aeruginosa פ. כמו כן עבור aeruginosa פ, הרג מאת faecalis אי הוא תלוי-זמן. בניגוד הקודם C. elegans– מבחניאי faecalis , וזמינותו שלנו עבור faecalis אי לא דורשת preinfection, שיפור פרופיל הבטיחות שלה והפחתת הסיכוי לזיהום ציוד למיון נוזלי. וזמינותו היא חזקה מאוד, מציג ~ 95% שיעורי המוות 96 h פוסט זיהום.
Introduction
בזיהוי ופיתוח של אפקטיביות, ותתנו לו אנטיביוטיקה, עכשיו כמעט לפני מאה שנה, הוביל רגע של התעוררות בתחום בריאות הציבור איפה שהיתה אמונה פרושות לרווחה כך זיהומיות מחלות יהיה יסורים של העבר. בתוך כמה עשורים קצר, האופטימיות הזו החלה לדעוך, כמו הפתוגן לאחר הפתוגן פיתחו מנגנוני ההתנגדות המוגבלת הטיפולים פעם מופלא. כבר כמה זמן, מרוץ החימוש בין במאמצי הגילוי סמים פתוגנים נראה מאוזן. עם זאת, ניצול לרעה של antimicrobials שהגיע לשיא לאחרונה לצמיחתה של זנים עמידים בפני פאן-התרופה של pneumoniae קלבסיאלה, Acinetobacter baumanii, בסרישיה marcescensו פ aeruginosa1, 3, 2,4.
Aeruginosa פ הוא הזדמנותית, גראם שלילי, מרובה מארחים הפתוגן שמהווה איום חמור לחולים עם כוויות חמורות, מי immunocompromised, או בעלי סיסטיק פיברוזיס. הוא גם יותר ויותר מזוהה בתור סוכן סיבתי זיהומים nosocomial חמורה, במיוחד בשל רכישתה מתמשך של עמידות מיקרוביאלית. כדי להתחיל לתת מענה לאיום הזה, השתמשנו את מתועדת היטב C. elegans–aeruginosa פ זיהום מערכת5. המעבדה שלנו יש ממונף מערכת זו לפתח פלטפורמה ההקרנה בנוזל, תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן כדי לזהות תרכובות הרומן להגביל את יכולתם של המחלה להרוג את המארח6. מסקרן, תרכובות אלו נראה שייך לפחות לשלוש קטגוריות כלליות, כולל antimicrobials7 והתקפה אלימה מעכבי8. אחרים מבחני גילוי סמים גבוהה-תוכן C . elegans דווחו Mycobacterium tuberculosum, כלמידיה trachomatis, Yersinia pestis, ליסטריה, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, קנדידה אלביקנס, ו Enterococcus faecalis, בין היתר9,10,11,12,13,14,15,16. סוגים אלה של מבחני יש מספר יתרונות מוכרת היטב, כגון הגבלת כניסות חיובי כוזב עלולים להיות רעילים הן המארח הפתוגן, גדל הסיכוי הזמינות הביולוגית לעומת מסך כימי, ואת היכולת לזהות את הלהיטים מעבר פשוט הגבלת צמיחת חיידקים, כגון אנטי-virulents, מערכת החיסון מולקולות מופחתים או תרכובות אחרת להטות את האיזון של אינטראקציה פתוגן-פונדקאי לטובת לשעבר. בנוסף, תרכובות גילה במסכים אלה הם לעתים קרובות יעיל בתרבית של המארחים.
ראוי לציין כי לפחות שני אחרים מבחני17,18 זמינים לביצוע בתפוקה גבוהה מסכי C . elegans בנוזל. עם זאת, כל אלה מבחני הוא שינוי המאפשר וזמינותו מעיים-קולוניזציה הטיפוסי, המכונה לאט-הרג, שיש לבצע בנוזל, הגדלת התפוקה ומאפשר תרכובות שיוקרנו בקלות רבה יותר. אפיון זהיר הוכיחה באופן סופי כי המנגנון של התקפה אלימה חיידקי הם שונים בין אלה מבחני שלנו בנוזל מסך7. מאז שני סוגי התקפה אלימה הם נצפו מערכות יונקים, חשוב לקחת בחשבון אילו דטרמיננטה התקפה אלימה רלוונטי ביותר עבור האינטרסים של הנסיין לפני בחירה וזמינותו.
כאן אנחנו מדגימים גירסה אופטימיזציה של בנוזל assay aeruginosa elegans-עמ’ ג . אנחנו גם לדווח על ההסתגלות בשיטה assay בנוזל שלנו כדי להכיל את פתוגן חיידקי גראם חיוביים Enterococcus faecalis. כמו aeruginosa פ, א faecalis יותר ויותר מזוהה איום רציני nosocomial עם חימוש הגוברת של עמידות מיקרוביאלית מסלולים1. למרות שיטה קודמת להקרנה תפוקה גבוהה של אי faecalis קיים14, זה דורש preinfection עם המחלה, אשר מסבך את ההליך, מגבירה את הסבירות של מזהם ציוד כמו FlowSort COPAS. פרוטוקול שלנו מבטלת את הצורך לפני הפגיעה, לשפר את פרופיל הבטיחות. לבסוף, אנו מדווחים על אמצעי שבאמצעותו משני מבחני אלה יכול להיות משולב עם האכלה RNAi, המאפשר למשתמש לחפש גורמים מארח לשחק תפקיד בהקמת, או התנגדות, זיהום.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה assay (או מבחני דומה שבו פתוגנים אחרים המוחלפים aeruginosa פ או faecalis א) שימושי למגוון רחב של מטרות, לרבות גילוי תרופות. זה שימושי גם למיעון שאלות הביולוגיים הבסיסיים, כגון בזיהוי הגורמים התקפה אלימה, הבהרה של המארח ההגנה מסלולים, וקביעת את הרגולציה והמיכון באינטראקציה פתוגן-פונדקאי.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מכון המחקר של טקסס (CPRIT) פרס RR150044, ולש קרן מחקר גרנט C-1930, ומניעת סרטן על ידי את נבחרת מוסדות של בריאות K22 AI110552 מוענק NVK. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
References
- Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
- Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
- Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
- Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
- Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
- Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
- Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
- Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
- Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
- Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
- Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167 (2013).
- Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
- Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
- Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
- Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189 (2014).
- Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18 (2007).
- Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540 (2009).
- Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
- Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
- Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
- Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876 (2017).
- Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
- Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
- Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).
