Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

Estudio de vesícula sináptica reciclaje es importante para determinar cómo cambian propiedades presinápticos, en plasticidad sináptica o en respuesta a la perturbación de la función sináptica. Estudio de Synaptotagmin-1 (Syt1) anticuerpos absorción proporciona un método para medir la cantidad de reciclaje de SV. Syt1 es una SV-proteína que actúa como un sensor de Ca^{2 +} y es necesario exocitóticas liberación del neurotransmisor^1,2. Es una proteína transmembrana con un dominio citoplásmico c-terminal fuera de la SV y un dominio luminal del N-terminal dentro del SV³. Durante la exocitosis, el dominio luminal de Syt1 queda expuesto al medio externo. A este medio externo, añadimos anticuerpos dirigidos contra el dominio citoplásmico, que se convierte en interiorizado durante la endocitosis. Estos anticuerpos pueden ser que ya sea previamente conjugado con fluoróforos o immunostained con anticuerpos secundarios^4,5,6,7. La intensidad de fluorescencia de la immunosignal resultante es proporcional a la cantidad de reciclaje de SV. Este enfoque puede utilizarse para determinar SV constitutiva e inducidas por despolarización reciclaje^6,8.

Ensayos de absorción de Syt1 pueden realizarse después de transferencia génica mediada por virus a prácticamente todas las células en el plato o escasa de la transfección de un pequeño número de células. Nuestro método combina el ensayo con escasa doble transfección de neuronas hippocampal primarias utilizando fosfato de calcio⁹. Utilizamos una proteína recombinante marcador sabida que se acumulan en presynapses, fluorescencia etiquetada Synaptophysin, localizar los terminales presinápticos y sobreexpresan la proteína de interés, Rogdi. Esto nos permite probar si o no Rogdi objetivos funcionales sinapsis y afecta a SV de reciclaje. La codificación Rogdi del gene fue identificado originalmente en una pantalla para mutantes de Drosophila caracterizados por alteración de la memoria¹⁰. En los seres humanos, mutaciones en el gene de Rogdi causan una enfermedad devastadora y rara llamada síndrome de Kohlschütter Tönz. Los pacientes sufren de malformaciones de esmalte dental, epilepsia farmacorresistente y retraso psicomotor; sin embargo, la localización subcelular del producto del gen seguía siendo evasiva¹¹. Así, el ensayo de absorción de Syt1 proporcionó evidencia clave para la localización de GFP con la etiqueta Rogdi en sinapsis funcional⁹.

Esta técnica de absorción tiene varios beneficios. En primer lugar, SV reciclaje puede observarse tanto en tiempo real realizando en proyección de imagen de^7,12y después de fijación^6,9 midiendo la intensidad de fluorescencia de la etiqueta de Syt1 fluorescencia. Además, se han desarrollado diversas variantes de anticuerpos Syt1. Hay variantes sin etiquetar que pueden ser etiquetadas con un anticuerpo secundario siguiendo un protocolo estándar immunostaining después de la fijación y variantes previamente conjugadas con una etiqueta de fluorescencia ya fijada. Finalmente, basados en anticuerpos de fluorescencia es ventajosa debido a la gran variedad de tintes secundarios o conjugados comercialmente disponibles que se pueden utilizar.

Cuando la fijación y el immunostaining las neuronas, también es posible teñir proteínas adicionales y realizar análisis de colocalización. Esto puede ayudar a determinar dónde se ubican en lo referente a reciclaje SVs. La intensidad de la etiqueta de la fluorescencia es la medida directa de la cantidad de SV de reciclaje. Además, los anticuerpos selectivamente etiqueta de Syt1 que contiene estructuras, dando por resultado alta especificidad y poca fluorescencia de fondo⁴. Diferentes protocolos de estimulación pueden usarse, como buffers de despolarización o estimulación eléctrica protocolos^9,12,13,14. Sin embargo, el reciclaje de SV básico puede medirse sin estimular los cultivos neuronales¹⁵.

Nuestro método dirige específicamente Syt1 absorción de anticuerpo en las neuronas transfectadas doble con inmunomarcación de anticuerpo secundario después de la fijación. Sin embargo, nos referimos a todas las variantes usadas rutinariamente el ensayo en nuestra discusión para dar a los espectadores una oportunidad para adaptar el protocolo a necesidades específicas.