Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Estudando a vesícula sináptica reciclagem é importante em determinar como alteram Propriedades pré-sináptica, durante a plasticidade sináptica, ou em resposta a perturbação da função sináptica. Estudando Synaptotagmin-1 (Syt1) captação de anticorpo fornece um método para medir a quantidade de reciclagem de SV. Syt1 é uma proteína de SV-associado que atua como um sensor de Ca^{2 +} e é necessária para os liberação do neurotransmissor^1,2. É uma proteína transmembranar com um domínio citoplasmático do C-terminal fora o SV e um domínio N-terminal do luminal dentro do SV³. Durante a exocitose, o domínio luminal de Syt1 torna-se exposto ao meio externo. Para este meio externo, acrescentamos anticorpos dirigidos contra o domínio citoplasmático, que se torna interiorizado durante a endocitose. Estes anticorpos podem ser que também pre-conjugados com fluorophores ou immunostained com anticorpos secundários^4,5,6,7. A intensidade da fluorescência do immunosignal resultante é proporcional à quantidade de reciclagem de SV. Esta abordagem pode ser usada para determinar o SV constitutiva e induzida por despolarização reciclagem^6,8.

Ensaios de absorção de Syt1 podem ser realizados após a transferência de genes mediada por vírus para praticamente todas as células no prato ou transfection esparso de um pequeno número de células. Nosso método combina o ensaio com esparso transfection duplo de neurônios hippocampal preliminares usando o fosfato de cálcio⁹. Nós usamos uma proteína recombinante marcador conhecida a acumular-se no presynapses, Sinaptofisina fluorescente etiquetada, localizar terminais pré-sináptica e overexpress nossa proteína de interesse, Rogdi. Isto permite-nos testar ou não Rogdi alvos funcionais sinapses e afeta SV reciclagem. O gene que codifica a Rogdi foi originalmente identificado em uma tela para mutantes de Drosophila, caracterizados pela memória prejudicada¹⁰. Em humanos, mutações no gene Rogdi causam uma doença rara e devastadora, chamada síndrome de Kohlschütter-Tönz. Os pacientes sofrem de malformações do esmalte dentário e pharmacoresistant epilepsia psicomotoras atrasos; no entanto, a Localização subcellular do produto gene permaneceu evasivo¹¹. Assim, o ensaio de absorção de Syt1 forneceu evidência chave para localização de GFP-etiquetado Rogdi às sinapses funcionais⁹.

Esta técnica de captação tem diversos benefícios. Primeiro, SV reciclagem pode ser observado tanto em tempo real através da realização de^7,de imagens ao vivo¹²e após fixação^6,9 , medindo a intensidade da fluorescência do rótulo Syt1 fluorescência. Além disso, foram desenvolvidas diversas variantes de Syt1 anticorpo. Existem variantes sem marcas de formatação que podem ser rotuladas com um anticorpo secundário, seguindo um protocolo padrão de imunocoloração após a fixação e variantes pre-conjugadas com um rótulo de fluorescência já anexado. Finalmente, baseados em anticorpo fluorescência é vantajosa devido a grande seleção de corantes secundários ou conjugados em comercialmente disponíveis que pode ser usado.

Quando fixação e imunocoloração os neurônios, é também possível mancha para proteínas adicionais e executar análise colocalization. Isto pode ajudar a determinar onde eles estão localizados em relação à reciclagem SVs. A intensidade do rótulo da fluorescência é a medida direta da quantidade de SV reciclagem. Além disso, os anticorpos seletivamente rotulam Syt1 contendo estruturas, resultando em alta especificidade e de fluorescência do pouco fundo⁴. Protocolos de estimulação diferentes também podem ser usados, tais como buffers de despolarização ou estimulação elétrica protocolos^9,12,13,14. No entanto, reciclagem de SV basal pode ser medida sem estimular as culturas neuronal¹⁵.

Nosso método trata especificamente a absorção de anticorpo Syt1 nos neurônios duplo-transfectadas com anticorpo secundário immunolabeling após a fixação. No entanto, nos referimos a todas as variantes rotineiramente utilizadas do ensaio em nossa discussão para dar aos espectadores a oportunidade de adaptar o protocolo para necessidades específicas.