Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

Étudier le recyclage de la vésicule synaptique est importante pour déterminer comment les propriétés présynaptiques changent, soit au cours de la plasticité synaptique, ou en réponse à la perturbation de la fonction synaptique. Étudier la synaptotagmine-1 (Syt1) absorption anticorps fournit une méthode de mesure de la quantité de recyclage de la SV. SYT1 est une protéine associée aux SV qui agit comme un capteur de Ca^{2 +} et est nécessaire pour la libération du neurotransmetteur^1,2exocytotique. C’est une protéine transmembranaire avec un domaine cytoplasmique C-terminal en dehors de la SV et un domaine luminal N-terminal à l’intérieur de la SV³. Au cours de l’exocytose, le domaine luminal de Syt1 devient exposé au milieu externe. Dans ce milieu externe, nous ajoutons des anticorps dirigés contre le domaine cytoplasmique, qui devient intériorisé au cours de l’endocytose. Ces anticorps peuvent être que soit des conjugués avec fluorophores ou immunomarquage avec anticorps secondaires^4,5,6,7. L’intensité de la fluorescence de l’immunosignal qui en résulte est proportionnelle à la quantité de recyclage de la SV. Cette approche peut servir à déterminer la SV constitutive et induite par une dépolarisation recyclage^6,8.

Essais de captation SYT1 peuvent être effectuées après le transfert de gène induite par le virus à presque toutes les cellules dans le plat ou après transfection clairsemée d’un petit nombre de cellules. Notre méthode allie l’analyse clairsemée double transfection des neurones de l’hippocampe primaires à l’aide de phosphate de calcium⁹. Nous utilisons une protéine recombinante marqueur connue pour s’accumuler à presynapses, synaptophysine fluorescent étiqueté, pour localiser les terminaisons présynaptiques et surexpriment notre protéine d’intérêt, Rogdi. Cela nous permet de tester si oui ou non Rogdi objectifs fonctionnels synapses et affecte SV recyclage. Le gène codant pour la Rogdi a été initialement identifié dans un écran pour des mutants de Drosophila caractérisées par des troubles de la mémoire¹⁰. Chez l’homme, des mutations du gène Rogdi causent une maladie rare et dévastatrice appelée syndrome de Kohlschütter-Tönz. Les patients souffrent de malformations de l’émail dentaire, l’épilepsie pharmacorésistantes et des retards psychomoteurs ; Cependant, la localisation subcellulaire du produit du gène est resté insaisissable¹¹. Ainsi, l’essai d’absorption Syt1 fourni des éléments de preuve fondamentaux pour la localisation de GFP-étiquetée Rogdi à synapses fonctionnelles⁹.

Cette technique d’absorption a plusieurs avantages. Tout d’abord, SV recyclage peut être observée aussi bien en temps réel en effectuant le live d’imagerie^7,12et après fixation^6,9 en mesurant l’intensité de la fluorescence de l’étiquette de fluorescence Syt1. En outre, plusieurs variantes d’anticorps Syt1 ont été développés. Il y a des variantes sans étiquette qui peuvent être marqués avec un anticorps secondaire suite à un protocole standard immunostaining après fixation et variantes des conjugués avec une étiquette de fluorescence déjà fixée. Enfin, la fluorescence à base d’anticorps est avantageuse en raison de la grande sélection de disponible dans le commerce secondaires ou conjugués des colorants qui peuvent être utilisés.

Lorsque fixation et immunostaining les neurones, il est également possible souiller des protéines supplémentaires et effectuer des analyses de colocalisation. Cela peut aider à déterminer où ils se trouvent en ce qui concerne le recyclage SVs. L’intensité de l’étiquette de fluorescence est la mesure directe de la quantité de SV recyclage. En outre, les anticorps étiquette sélectivement les structures contenant Syt1, ayant pour résultat une spécificité élevée et peu de fluorescence de fond⁴. Protocoles de stimulation différents permet également, tels que les tampons de dépolarisation ou protocoles de stimulation électrique^9,12,13,14. Toutefois, les basales SV recyclage peut être mesurée sans stimuler les cultures de neurones¹⁵.

Notre méthode s’adresse spécifiquement Syt1 absorption d’anticorps dans les neurones double transfectées avec l’anticorps secondaire immunomarquage après fixation. Cependant, nous nous référons à toutes les variantes utilisées systématiquement du dosage dans notre discussion pour donner aux téléspectateurs l’occasion d’adapter le protocole à des besoins spécifiques.