I denne protokollen beskriver vi en brønnene metode for å direkte bruke en kontrollert kraft på kjernen i en levende celle. Denne analysen kan avhør av kjernefysiske mekaniske egenskaper i levende, tilhenger cellen.
Mekaniske egenskaper for kjernen bestemme sitt svar på mekaniske krefter generert i celler. Kjernen er molecularly kontinuerlig med cytoskjelett, for metoder å undersøke sin mekanisk oppførsel i tilhenger celler. Her diskuterer vi direkte force sonden (DFP) som et verktøy for å bruke makt direkte til kjernen i en levende tilhenger celle. Vi legger smale brønnene til kjernefysiske overflaten med sugekraft. Brønnene er oversatt fra kjernen, som forårsaker kjernen å deformere og oversette. Når gjenopprette er lik sugekraft styrken, kjernen løsner og slapper elastisk. Fordi inntaks press er nøyaktig kjent, er styrken på kjernefysiske overflaten kjent. Denne metoden har avdekket at nano-skala styrker er tilstrekkelig å deformere og oversette kjernen i tilhenger celler, og identifisert cellen cytoskjelett elementer som aktiverer kjernen å motstå styrker. DFP kan brukes å analysere bidrag av mobilnettet og kjernefysiske komponenter kjernefysiske mekaniske egenskaper i levende celler.
Patologi som kreft innebære endringer i kjernefysiske form og struktur1,2, som er vanligvis ledsaget av en “mykgjøringen” av kjernen3,4. Kjernefysiske motstand mot mekanisk deformasjon har vært generelt karakterisert ved å bruke en isolert kjerner5.
Kjernen i celler er molecularly knyttet til cytoskjelett Linker av Nucleoskeleton og Cytoskeleton (LINC) komplekse6,7,8,9. Resultatet er kjernen mekanisk integrert med cytoskjelett, og gjennom celle-undergrunnen adhesjon, den ekstracellulære matrisen. Mekanisk prøvende kjernen i tilhenger cellene kan gi innsikt i mekanisk integrering. Metoder for å manipulere kjerner i levende celler inkluderer brønnene aspirasjon10,11og atomic force mikroskopi12,13,14. Vi har nylig beskrevet en direkte force sonde (DFP) som gjelder mekaniske krefter på kjernen i en levende tilhenger celle15.
Her skissere vi fremgangsmåten for å bruke et microinjection system som er allment tilgjengelig i mikroskopi anlegg å bruke en kjent, nano-skala mekanisk kraft direkte på kjernen i en tilhenger celle. En femtotip (0,5 µm diameteren brønnene tips) er montert og koblet til microinjection systemet med et rør. Spissen, plassert i en vinkel på 45 grader i forhold til overflaten av kultur fatet, senkes til ved siden av kjernefysiske overflaten. Røret er deretter koblet og åpnet i atmosfæren, som skaper en negativ inntaks press på kjernefysiske overflaten og sel brønnene spissen mot kjernefysiske overflaten. Gjennom oversettelse brønnene tips, er kjernen deformert og til slutt (avhengig av omfanget av kraften), løsrevet fra brønnene. Denne avdeling oppstår når de gjenopprette (motstå) styrkene, utøves av kjernen og celle, lik sugekraft kraften fra brønnene. Analyse kan utføres ved å måle forskyvning av kjernen, lang stamme (formel 1) eller området belastningen (figur 1A).
Måle mekanisk integrering av kjernen med cytoskeleton er en utfordring for nyeste metoder, for eksempel brønnene aspirasjon16, fordi de krever enten isolert kjerner (der kjernen er avparet fra cytoskeleton) eller kjerner i suspendert celler (der ekstracellulære styrker, som trekkraft styrker, er fraværende). Force utlignet til kjernen ved å bruke biaxial belastning celler tilhenger til en membran17,18; men er denne teknikken begrenset…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 EB014869.
FluoroDish | WPI | FD35 | |
SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |