הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר
Summary
כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.
Abstract
קליפת בתרבית של מורכב של סוגים רבים של נוירונים סינאפסות, כל אחד עם מאפייני אלקטרופיזיולוגיות וביוכימי ספציפיים, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו , אבל שלהם basic אנטומי פונקציונלי הארגון של הסלולר לקנה המידה רשת ממעטים להבין. כאן נתאר שיטת ההדמיה תלת מימדי של נוירונים שכותרתו fluorescently על פני שטחים נרחבים של המוח לחקירה של הארגון סלולרי קורטיקלית. סוגי נוירונים ספציפיים מסומנים על ידי ההזרקה של פלורסנט המשדרים עצביים רטרוגרדית או ביטוי של חלבונים פלורסנט ב העכברים הטרנסגניים. בלוק המוח דגימות, למשל, האונה, המוכנים על קיבעון, עשה שקוף עם רקמת ניקוי שיטות, נתון פלורסנט immunolabeling של סוגי תאים מסוים. אזורים גדולים נסרקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים מצויד גדול לעבוד מרחק מטרות ושלבים ממונע. בשיטה זו ניתן לפתור הארגון תקופתי של המודולים פונקציונליים ייחודיים לסוג microcolumn תא בתוך קליפת העכבר. ההליך יכול להיות שימושי לצורך המחקר של אדריכלות סלולרית תלת מימדי אזורי מוח שונים וברקמות מורכבים אחרים.
Introduction
קליפת בתרבית של מורכב של מספר רב של סוגי תאים, אחד עם דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, אלקטרופיזיולוגיות ומאפייני הביוכימי, קשרים סינפטיים, ופונקציות ויוו 1,2 ,3,4,5,6,7. בין אם אלה סוגי תאים מאורגנים מבנים חוזרים ונשנים כבר לא ברור. קורטיקלית, כולל העמודות האוריינות החזותית וחביות המגע, יש לחזור על מבנים, אך הארגון הסלולר שלהם נשאר לא ברור8,9. אלה נמצאים אזורים קורטיקליים מסוימים והם אינם המערכת כולו במוח.
בשכבה neocortical 5, רובם המכריע של נוירונים מסווגים לארבעה סוגים עיקריים. סוג העיקריים של נוירונים סינאפסות, הקרנה מוחי תת הנוירונים, פרויקטים אקסונים אל המטרות subcortical לרבות פונס, חוט השדרה, רקתי עליון ומייצג, לכן, מסלול פלט קורטיקלית הגדולות10. הקרנה קורטיקלית הנוירונים, סוג מרכזי נוסף של הנוירונים סינאפסות, innervate קליפת10. נוירונים מעכבות גם להכיל שני מעמדות עיקריים: תאים parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין11.
ניתוחים אחרונים מציינים סוגי תאים ארבע מאורגנות מבנים חוזרים ונשנים12,13,14. הקרנה מוחי תת נוירונים12,13,14 והן נוירונים בקליפת המוח הקרנה14 לארגן סוג התא microcolumns ספציפיים בקוטר של 1-2 תאים. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין ישר במיוחד microcolumns של נוירונים הקרנה מוחי תת אבל לא עם microcolumns של נוירונים בקליפת המוח הקרנה14. Microcolumns את עצמם מעת לעת יתיישר טופס משושה סריג מערך14 , קיימים אזורים קורטיקליים מרובים כולל אזורים חזותי, המגע, מנוע12,מוח העכבר14 בשפה אזורי המוח האנושי13. נוירונים ב- microcolumn בודדים התערוכה פעילות מסונכרנת ויש תגובות החישה דומה14. מקרים אלה מצביעים על סוגי תאים בשכבה 5 לארגן לתוך מבנה סריג microcolumn המייצג הארגון ברחבי המוח הידוע הראשון של חוזרות מודולים פונקציונליים.
Microcolumns יש רדיוס של 10 מיקרומטר ויש על תקופתיות המרחבי כ-40 מיקרומטר. בנוסף, כיוון microcolumns הוא מקביל שלהם דנדריטים הפסגה, משתנה בהתאם למיקום שלהם ב- קליפת14. לכן, מערכת microcolumn קשה לנתח באמצעות פרוסות קורטיקלית קונבנציונאלי עם עובי טיפוסי של כמה עשרות מיקרומטר. בנוסף, הניתוח של תקופתיות דורשת נתונים תלת-ממדיים של מגוון רחב של אזורים במוח, ולכן אזור ההדמיה טיפוסי של מיקרוסקופיה קונפוקלית או ויוו הדמיה 2-פוטון הוא צר מדי.
לאחרונה פותחו טכניקות כדי לנקות רקמות בעובי15,16. כאן נתאר היישום של שיטות אלה כדי להשיג בקנה מידה גדול, תלת מימדי תמונות הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר 5 המרכיבים את המערכת microcolumn. הקרנת subcerebral נוירונים מסומנים על-ידי תיוג רטרוגרדית או הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת ב- Crym-egfp העכברים הטרנסגניים12, והקרנה קורטיקלית נוירונים מסומנים על-ידי גם הכוכבים תיוג או על-ידי הביטוי tdTomato ב Tlx3–cre-/Ai9-עכברים-17. תאים Parvalbumin-להביע ולבטא סומטוסטטין מסומנות על ידי אימונוהיסטוכימיה. שיטה (נוגדן בקנה מידה S) AbScale18 משמש הנוגדן מכתים ניסויים, ואילו בשיטה SeeDB (ראה מוחי עמוק)19 משמש לניסויים אחרים. שיטות אלה להתגבר על הקשיים הנ של שיטות הדמיה קונבנציונאלי ולחשוף הארגון הסלולר מדויק של שכבה 514.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוצגו הליכים כדי לקבל תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה גדול של הארגון ייחודיים לסוג התא הסוגים העיקריים התא בשכבה neocortical העכבר, 5. לעומת ההכתמה פרוסה קונבנציונאלי, השיטה זו יותר שימושי לקביעת הארגון תלת מימדי של קליפת. השיטה מאפשרת ייבוא תמונות מ רחבה יותר, האזורים במוח עמוק יותר בהשוואה טיפוסי …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אטסשי המייאוואקי וחמאת הירושי לעצה שלהם על הניסויים elAbSca, צ’ארלס Yokoyama לעריכה של כתב היד, Ohshima אריקו, מיוקי Kishino לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמך על ידי קרנות מחקר של RIKEN תוצרת הארץ, Grants-in-Aid למחקר מדעי של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) של יפן כדי תוצרת הארץ (אזורים חדשני “Mesoscopic Neurocircuitry”; 22115004), אס (25890023).
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be?. Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
