تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس
Summary
هنا يصف لنا إجراء لإزالة الأنسجة ووسم الفلورسنت والتصوير على نطاق واسع لانسجة المخ الماوس الذي، وبالتالي يمكن تصور منظمة ثلاثية الأبعاد لأنواع الخلايا في اللحاء الجديد.
Abstract
يتكون اللحاء الجديد الثدييات من أنواع عديدة من الخلايا العصبية ضادات والمثبطة، كل منها مع الخصائص الكهربية والبيوكيميائية، اتصالات متشابك، و في فيفو الوظائف، ولكن الأساسية الوظيفية والتشريحية المنظمة من الهاتف الخلوي إلى نطاق الشبكة هو غير مفهومة. هنا يصف لنا طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي عبر مناطق واسعة من الدماغ لتحقيق المنظمة الخلوية القشرية. أنواع معينة من الخلايا العصبية المسماة بحقن الفلورسنت تتبع الخلايا العصبية إلى الوراء أو تعبير البروتينات الفلورية في الفئران المعدلة وراثيا. عينات كتلة الدماغ، مثلاً، نصف الكرة الغربي، أعد بعد التثبيت، التي تتسم بالشفافية مع أنسجة تطهير الطرق، ويتعرضون إلى إيمونولابيلينج الفلورية لأنواع محددة من الخلايا. يتم تفحص مناطق كبيرة باستخدام مجاهر [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مجهزة بعمل كبير المسافة الأهداف والمراحل مزودة بمحركات. هذا الأسلوب يمكن حل المنظمة الدوري microcolumn الخاصة بنوع الخلية الوحدات الوظيفية في اللحاء الجديد الماوس. يمكن أن يكون هذا الإجراء مفيداً لدراسة البنية الخلوية ثلاثية الأبعاد في مجالات متنوعة من الدماغ والأنسجة المعقدة الأخرى.
Introduction
اللحاء الجديد الثدييات يتكون من عدد كبير من أنواع الخلايا، كل مع أنماط التعبير الجيني محددة، الخصائص البيوكيميائية والكهربية، والاتصالات متشابك، و في فيفو وظائف1،2 ،3،،من45،،من67. ما إذا كان يتم تنظيم أنواع هذه الخلية في هياكل المتكررة كانت غير واضحة. أعمدة القشرية، بما في ذلك الأعمدة المرئية التوجه وبرميل somatosensory، كررنا الهياكل، ولكن منظمتهم الخلوية ما زال غير واضح8،9. هذه موجودة في المناطق القشرية محددة ولا نظام على مستوى الدماغ.
وتصنف في طبقة نيوكورتيكال 5، الغالبية العظمى من الخلايا العصبية إلى أربعة أنواع رئيسية. نوع رئيسي من ضادات الخلايا العصبية، الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط، مشاريع محاور عصبية لأهداف subcortical منها بونس والحبل الشوكي، ووالاكيميه متفوقة، وعليه، يمثل مسار الإخراج القشرية الرئيسية10. الإسقاط القشرية الخلايا العصبية، نوع رئيسي آخر من ضادات الخلايا العصبية، يعصب قشرة10. الخلايا العصبية المثبطة تحتوي أيضا على الفئات الرئيسية هما: الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين11.
وتشير التحليلات الأخيرة إلى أن يتم تنظيم أنواع الخلايا الأربع في هياكل المتكررة12،،من1314. تنظيم الإسقاط الدماغي دون الخلايا العصبية12،،من1314 والإسقاط القشرية الخلايا العصبية14 في ميكروكولومنس نوع من الخلايا المحددة التي يبلغ قطرها 1-2 الخلايا. محاذاة الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين على وجه التحديد مع ميكروكولومنس من الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط ولكن ليس مع ميكروكولومنس من الإسقاط القشرية الخلايا العصبية14. ميكروكولومنس أنفسهم محاذاة دورياً للنموذج سداسية شعرية الصفيف14 وهي موجودة في المناطق القشرية متعددة بما في ذلك المناطق المرئية وسوماتوسينسوري والحركية في الدماغ الماوس12،14 وفي اللغة مناطق الدماغ البشري13. الخلايا العصبية في microcolumn الفردية، معرض الأنشطة المتزامنة واستجابات حسية مشابهة14. هذه الملاحظات تشير إلى أن تنظيم الطبقة 5 أنواع الخلايا في بنية شعرية microcolumn الذي يمثل أول منظمة على مستوى الدماغ المعروفة من تكرار وحدات وظيفية.
ميكروكولومنس دائرة نصف قطرها حوالي 10 ميكرون ويكون تواتر مكانية لحوالي 40 ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، اتجاه ميكروكولومنس موازية dendrites قمي والتغييرات تبعاً لموقفها في قشرة14. ولذلك، من الصعب النظام microcolumn لتحليل استخدام شرائح القشرية التقليدية مع سمك نموذجي من بضع عشرات من ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب تحليل تواتر البيانات ثلاثية الأبعاد من مجموعة واسعة من مناطق الدماغ، وبالتالي، منطقة التصوير نموذجية للفحص المجهري [كنفوكل] أو في فيفو التصوير 2-فوتون ضيقة للغاية.
في الآونة الأخيرة، تم وضع تقنيات لمسح أنسجة سميكة15،16. هنا يصف لنا تطبيق هذه الأساليب للحصول على صور ثلاثية الأبعاد على نطاق واسع، ومن أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5 التي تشمل نظام microcolumn. الإسقاط سوبسيريبرال الخلايا العصبية المسماة بالتالي إلى الوراء أو بالتعبير عن البروتين الفلورية الخضراء المعززة في الفئران المعدلة وراثيا اجفب كريم 12، والإسقاط القشرية المسماة الخلايا العصبية التي أما رجعية وضع العلامات أو بتعبير تدتوماتو في Tlx3–لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران17. الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين الخلايا المسماة إيمونوهيستوتشيميستري. يستخدم الأسلوب (جسم مقياس S) أبسكاله18 لجسم تلطيخ التجارب، في حين يتم استخدام أسلوب سيدب (انظر الدماغ العميق)19 لتجارب أخرى. التغلب على الصعوبات المشار إليها أعلاه من أساليب التصوير التقليدية هذه الأساليب وتكشف عن تنظيم طبقة 514دقيقة الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قدمنا إجراءات للحصول على صور ثلاثية الأبعاد الواسعة النطاق للمنظمة خلية نوع معين من أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5. مقارنة لتلطيخ شريحة التقليدية، يكون الأسلوب أكثر فائدة في تحديد منظمة ثلاثية الأبعاد من اللحاء الجديد. الأسلوب الذي يتيح الحصول على الصور من نطاق أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أتسوشي ميياواكي وحماه هيروشي لمشورتها على تجارب هلأبسكا، تشارلز يوكوياما لتحرير المخطوطة، Eriko Ohshima وكيشينو ميوكي للمساعدة التقنية التي تقدمها. هذا العمل كان تدعمها أموال البحوث من بتبريد T.H. ومعونة “البحث العلمي” من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) من اليابان إلى T.H. (المجالات المبتكرة “Mesoscopic نيوروسيركويتري”؛ 22115004) و س. س. (25890023).
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be?. Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
