Her presenterer vi en protokoll for å isolere fucoxanthin klorofyll a/c bindende proteiner (FCP) fra kiselalger og innlemme dem i liposomer med naturlig lipid komposisjoner å studere eksitasjon energioverføring på ion justeringsendringer.
Fotosynteseaktiviteten ytelsen til, alger og kiselalger avhenger sterkt på rask og effektiv regulering av lyset høsting og energi overføring prosesser i thylakoid membran av chloroplasts. Lyset høsting antenne av kiselalger, de såkalte fucoxanthin klorofyll a/c bindende proteinene (FCP), kreves for lys absorpsjon og effektiv overføring til fotosynteseaktiviteten reaksjonen sentre også for bilde-mot overdreven lys. Bytt mellom disse to funksjonene er en langvarig forskning. Mange av disse studiene har utført med FCP i vaskemiddel micelles. For samhandling studier, er vaskemidler fjernet, og som førte til en uspesifikke samling av FCP komplekser. I denne metoden er det vanskelig å forskjellsbehandle gjenstander og fysiologisk relevante data. Derfor kan mer verdifull informasjon om FCP og andre membran bundet lette høsting komplekser fås ved å studere protein-protein interaksjoner, energioverføring og andre spektroskopiske funksjoner hvis de er innebygd i deres opprinnelige lipid miljø. Hovedfordelen er at liposomer har en definert størrelse og en definert lipid/protein som omfanget av FCP klynging er kontrollert. Videre kan enkelt endringer i pH og ion sammensetningen som regulerer lys høsting i vivo simuleres. I forhold til thylakoid membranen er liposomer mer homogen og mindre komplisert, som gjør det enklere å få og forstå spektroskopiske data. Protokollen beskriver fremgangsmåten FCP isolasjon og rensing, liposome forberedelse og inkorporering av FCP liposomer naturlig lipid sammensetning. Resultater fra en typisk applikasjon er gitt og diskutert.
Fotosynteseaktiviteten organismer som kiselalger må takle skiftende lysforhold og svare med sofistikert acclimation mekanismer som opprettholde høy fotosynteseaktiviteten effektivitet og beskytte mot Foto-oksidative skader forårsaket av overdreven lyset. En viktig lysbeskyttende prosess i fotosynteseaktiviteten eukaryoter kommer høy energi slukke (E) absorbert lys som forekommer som det viktigste bidraget til de ikke-fotokjemisk slukke (NPQ) under lette stress forhold1,2 ,3. Lette høsting antenne komplekser (LHC) er involvert i regulering av eksitasjon energi overføring trasé. Svar på høy lys indusert lav pH i chloroplast lumen, antenne system bryterne fra lyset høsting å slukke staten. Denne energien dissipative staten beskytter photosystems (PS) og andre komplekser i thylakoid membranen fra foto-oksidasjon. I fotosynteseaktiviteten eukaryoter, er qE vanligvis forårsaket av to faktorer1,2,3. En faktor som er spesialisert lyset høsting protein som svarer til den lave pH. PsbS protein induserer qE i høyere planter4. LhcSRs5, modulert av PsbS aktivitet, indusere qE i grønne alger6. Kiselalger har Lhcx-lignende proteiner som strukturelt relatert til LHCSRs7,8,9,10.
Den andre faktoren qE er den xanthophyll syklusen der karotenoider av antennen er konvertert til en foto-beskyttende de-epoxidation og erstattet av epoxidation. I planter og grønne alger konverteres violaxanthin til zeaxanthin. I kiselalger konverteres diadinoxanthin til diatoxanthin, som deretter korrelerer med omfanget av NPQ11. Slektene lyset høsting antenne besitter noen selv om det er evolusjonære anlegget og alger LHCs. Overgangen fra lys høsting Foto-beskyttelse er enormt rask og NPQ kapasitet er høyere sammenlignet med planter12. Dette kan være en grunn til hvorfor Kiselalger er svært vellykket i ulike økologiske nisjer slik at de er ansvarlige for opptil 45% av oceanic netto primærproduksjon13. Derfor slektene lys høstingen systemer er en interessant gjenstand for fotosyntesen forskning.
Kiselalger, som sentriske arten Cyclotella meneghiniana, har thylakoid innebygd lys høstingen systemer oppkalt etter pigmentene de bind – fucoxanthin, klorofyll (chl) a og c, derav FCP. lys høsting proteiner, som FCPs, er innebygd i thylakoid membran som består av flere membran lag. Kiselalger danne band av tre thylakoids. Dette komplekset situasjonen gjør det vanskelig å studere dem på molekylært nivå i thylakoid membranen. I tillegg bidrar mange komponenter til regulering av lys høsting (se ovenfor). Derfor i mange tilnærminger ble komplekser isolert fra membranen bruke milde vaskemidler, som n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), som solubilize membran, men beholder FCP komplekser. Mange spektroskopiske studier ble utført med solubilized FCP for å undersøke intramolekylære energi overføring14,15,16,17. Denne tidligere var imidlertid begrenset siden regulering av energioverføring trenger excitonic interaksjon med andre antenne komplekser eller photosystems. Dermed slike studier kan ikke utføres med solubilized komplekser fordi samspillet mellom komplekser er tapt.
En viktig funksjon i antenne regulering er “molekylær trengsel” antenne og photosystems i thylakoid membran18. Tidligere, en enkel tilnærming ble utført for å simulere denne effekten i vitro. Vaskemiddel ble fjernet, noe som fører til tilfeldig samling av antenne komplekser. Selv om noen rimelig data ble innhentet av denne tilnærmingen17,19, vaskemiddel fjerning reflekterer ikke situasjonen i vivo og har noen begrensninger siden komplekser ikke er samhandlende på deres vanlige tertiær struktur.
Bruk av liposomer overvinner flere av de tidligere begrensningene. Tertiær strukturen er fortsatt fullt intakt. Liposome membranen tilbyr en kvasi innfødt miljø for antenne komplekser. Membranen skiller innsiden av liposome fra det ytre miljøet. Med disse midler gir liposomer to reaksjon rom for studier av ion og pH forløpningene for transport prosesser. Videre kan parameterne for eksperimentell systemet styres lettere for studier i thylakoid membranen. Liposomer var allerede vist seg å være et utmerket verktøy for å studere fotosynteseaktiviteten komplekser. Fokus i fortiden var på anlegget LHC hvor effekten av endrede lipid komposisjon ble testet på LHC II20. I andre tilnærminger, protein-protein samspillet mellom ulike LHC II ble undersøkt21. Også ble noen studier i grønne alger utført som beskriver spontan klynging mellom LHC22. Vurderer betydningen av kiselalger for akvatiske økosystemer, relativt få studier som ble utført med antenne komplekser av kiselalger. To studier undersøkt antenne komplekser av sentriske Cyclotella meneghiniana, der klynging FCP antenne23 og responsen til FCP til elektrokjemiske graderinger24 ble vist. Dermed er liposomer et utmerket verktøy for å studere slektene antenner og samhandling og regulering i nesten innfødt forhold. Liposomer er allsidig siden mange forhold som lipid komposisjon, liposome størrelse, protein tetthet og den omkringliggende vandige fasen kan kontrolleres. Videre krever metoden lave mengder prøver. Eksperimentell systemet er robust og svært reproduserbare. Compartmentalization av liposomer kan studere pH og ion graderinger, som er viktige faktorer i regulering av antenne komplekser.
Her beskriver vi isolering av FCP antenne komplekser fra C. meneghiniana og deres innlemmelse i liposomer med naturlig thylakoid lipid komposisjon. Også vi gi eksemplarisk data for spektroskopiske karakterisering av solubilized FCP og sammenligne dem med FCP i liposomer. Metoden oppsummerer kunnskap og standardiserte protokoller fra forbedringer av Gundermann og Büchel 201223og Natali et al. 201622Ahmad og Dietzel 201724.
Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten. (1) refererer til avsnitt 1 som beskriver cellevekst, avbrudd og thylakoid isolasjon med følgende FCP separasjon på sukrose tetthet forløpninger; C. m. –Cyclotella meneghiniana celler. (2) utarbeidelse av naturlige thylakoid lipid blanding (MGDG, DGDG og SQDG) beskrevet i avsnitt 2 og etableringen av lipid-rengjøringsmiddel micelles med octylglycoside (OG). En definert lipid-micelle størrelse oppnås ved ekstrudering bruker membraner med definerte pore diameter. FCP og lipid-micelles er samlet på en forhåndsdefinert lipid: protein forholdet og vaskemidler OG og β-DDM er fjernet via kontrollert dialyse danner FCP proteoliposomes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
FCP liposomer med naturlig lipid komposisjon gir en praktisk, enkel og reproduserbar verktøyet for å undersøke spektroskopiske egenskaper i vitro. Lipid miljøet FCP liposomer ligner situasjonen innen thylakoid membran, gir opphav til eksperimentelle resultater som er naturlige forhold.
Det er flere fordeler med å bruke C. meneghiniana som et modellsystem for FCP antenne. Det vokser relativt fort og mer robust i forhold til andre slektene modell arter, eksempelvis Tha…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Rana Adeel Ahmad for hjelp i FCP rensing. Prof Claudia Büchel er anerkjent for nyttig diskusjoner og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tysk Research Foundation til LD (DI1956-1/1) og Humboldt grunnlaget for en Fjodor Lynen fellesskap til LD.
500 ml centrifuge vials | |||
high speed centrifuge | Heraeus | ||
Bead Mill VI 2 | Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) | newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6 | |
Silibeads S 400 µm | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
VitraPOR filter funnel – por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
Ultracentrifuge Discovery 90SE | Sorvall | n.a. | |
rotor T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
Neubauer Cell Counter Chamber (improved) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
optical glass cuvettes (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
rotor AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff | Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | 1610449 | |
libre office spread sheet | The document foundation | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
SDS-loading buffer Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
n-octyl β-D-glucopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | make stock solution in chloroform |
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | make stock solution in chloroform |
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | make stock solution in chloroform |
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | make stock solution in chloroform |
L-α-Phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | make stock solution in chloroform |
sonicator bath S-50TH | Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
mini-Extruder | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
Nuleopore polycarbonate membrane | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | boil in destilled water before use |
Biobeads SM2 Adsorbent | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
sucrose epichlorhydrin copolymer – Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
rotor TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
material listed in order of appearance | |||
For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. | |||
Standard lab material and substances are not listed. |