Isolere og innlemme lys-fangst antenner fra slektene Cyclotella Meneghiniana i liposomer med Thylakoid lipider

Fotosynteseaktiviteten organismer som kiselalger må takle skiftende lysforhold og svare med sofistikert acclimation mekanismer som opprettholde høy fotosynteseaktiviteten effektivitet og beskytte mot Foto-oksidative skader forårsaket av overdreven lyset. En viktig lysbeskyttende prosess i fotosynteseaktiviteten eukaryoter kommer høy energi slukke (_E) absorbert lys som forekommer som det viktigste bidraget til de ikke-fotokjemisk slukke (NPQ) under lette stress forhold^{1,2 ,3}. Lette høsting antenne komplekser (LHC) er involvert i regulering av eksitasjon energi overføring trasé. Svar på høy lys indusert lav pH i chloroplast lumen, antenne system bryterne fra lyset høsting å slukke staten. Denne energien dissipative staten beskytter photosystems (PS) og andre komplekser i thylakoid membranen fra foto-oksidasjon. I fotosynteseaktiviteten eukaryoter, er q_E vanligvis forårsaket av to faktorer^1,2,3. En faktor som er spesialisert lyset høsting protein som svarer til den lave pH. PsbS protein induserer q_E i høyere planter⁴. LhcSRs⁵, modulert av PsbS aktivitet, indusere q_E i grønne alger⁶. Kiselalger har Lhcx-lignende proteiner som strukturelt relatert til LHCSRs^7,8,9,10.

Den andre faktoren q_E er den xanthophyll syklusen der karotenoider av antennen er konvertert til en foto-beskyttende de-epoxidation og erstattet av epoxidation. I planter og grønne alger konverteres violaxanthin til zeaxanthin. I kiselalger konverteres diadinoxanthin til diatoxanthin, som deretter korrelerer med omfanget av NPQ¹¹. Slektene lyset høsting antenne besitter noen selv om det er evolusjonære anlegget og alger LHCs. Overgangen fra lys høsting Foto-beskyttelse er enormt rask og NPQ kapasitet er høyere sammenlignet med planter¹². Dette kan være en grunn til hvorfor Kiselalger er svært vellykket i ulike økologiske nisjer slik at de er ansvarlige for opptil 45% av oceanic netto primærproduksjon¹³. Derfor slektene lys høstingen systemer er en interessant gjenstand for fotosyntesen forskning.

Kiselalger, som sentriske arten Cyclotella meneghiniana, har thylakoid innebygd lys høstingen systemer oppkalt etter pigmentene de bind – fucoxanthin, klorofyll (chl) a og c, derav FCP. lys høsting proteiner, som FCPs, er innebygd i thylakoid membran som består av flere membran lag. Kiselalger danne band av tre thylakoids. Dette komplekset situasjonen gjør det vanskelig å studere dem på molekylært nivå i thylakoid membranen. I tillegg bidrar mange komponenter til regulering av lys høsting (se ovenfor). Derfor i mange tilnærminger ble komplekser isolert fra membranen bruke milde vaskemidler, som n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), som solubilize membran, men beholder FCP komplekser. Mange spektroskopiske studier ble utført med solubilized FCP for å undersøke intramolekylære energi overføring^14,15,16,17. Denne tidligere var imidlertid begrenset siden regulering av energioverføring trenger excitonic interaksjon med andre antenne komplekser eller photosystems. Dermed slike studier kan ikke utføres med solubilized komplekser fordi samspillet mellom komplekser er tapt.

En viktig funksjon i antenne regulering er “molekylær trengsel” antenne og photosystems i thylakoid membran¹⁸. Tidligere, en enkel tilnærming ble utført for å simulere denne effekten i vitro. Vaskemiddel ble fjernet, noe som fører til tilfeldig samling av antenne komplekser. Selv om noen rimelig data ble innhentet av denne tilnærmingen^17,19, vaskemiddel fjerning reflekterer ikke situasjonen i vivo og har noen begrensninger siden komplekser ikke er samhandlende på deres vanlige tertiær struktur.

Bruk av liposomer overvinner flere av de tidligere begrensningene. Tertiær strukturen er fortsatt fullt intakt. Liposome membranen tilbyr en kvasi innfødt miljø for antenne komplekser. Membranen skiller innsiden av liposome fra det ytre miljøet. Med disse midler gir liposomer to reaksjon rom for studier av ion og pH forløpningene for transport prosesser. Videre kan parameterne for eksperimentell systemet styres lettere for studier i thylakoid membranen. Liposomer var allerede vist seg å være et utmerket verktøy for å studere fotosynteseaktiviteten komplekser. Fokus i fortiden var på anlegget LHC hvor effekten av endrede lipid komposisjon ble testet på LHC II²⁰. I andre tilnærminger, protein-protein samspillet mellom ulike LHC II ble undersøkt²¹. Også ble noen studier i grønne alger utført som beskriver spontan klynging mellom LHC²². Vurderer betydningen av kiselalger for akvatiske økosystemer, relativt få studier som ble utført med antenne komplekser av kiselalger. To studier undersøkt antenne komplekser av sentriske Cyclotella meneghiniana, der klynging FCP antenne²³ og responsen til FCP til elektrokjemiske graderinger²⁴ ble vist. Dermed er liposomer et utmerket verktøy for å studere slektene antenner og samhandling og regulering i nesten innfødt forhold. Liposomer er allsidig siden mange forhold som lipid komposisjon, liposome størrelse, protein tetthet og den omkringliggende vandige fasen kan kontrolleres. Videre krever metoden lave mengder prøver. Eksperimentell systemet er robust og svært reproduserbare. Compartmentalization av liposomer kan studere pH og ion graderinger, som er viktige faktorer i regulering av antenne komplekser.

Her beskriver vi isolering av FCP antenne komplekser fra C. meneghiniana og deres innlemmelse i liposomer med naturlig thylakoid lipid komposisjon. Også vi gi eksemplarisk data for spektroskopiske karakterisering av solubilized FCP og sammenligne dem med FCP i liposomer. Metoden oppsummerer kunnskap og standardiserte protokoller fra forbedringer av Gundermann og Büchel 2012²³og Natali et al. 2016²²Ahmad og Dietzel 2017²⁴.

Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten. (1) refererer til avsnitt 1 som beskriver cellevekst, avbrudd og thylakoid isolasjon med følgende FCP separasjon på sukrose tetthet forløpninger; C. m. –Cyclotella meneghiniana celler. (2) utarbeidelse av naturlige thylakoid lipid blanding (MGDG, DGDG og SQDG) beskrevet i avsnitt 2 og etableringen av lipid-rengjøringsmiddel micelles med octylglycoside (OG). En definert lipid-micelle størrelse oppnås ved ekstrudering bruker membraner med definerte pore diameter. FCP og lipid-micelles er samlet på en forhåndsdefinert lipid: protein forholdet og vaskemidler OG og β-DDM er fjernet via kontrollert dialyse danner FCP proteoliposomes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.