Isolere og indarbejde lys-høst antenner fra Diatom Cyclotella Meneghiniana i Liposomer med tylakoid lipider

Fotosyntetiske organismer såsom kiselalger skal håndtere skiftende lysforhold og reagere med sofistikerede acclimation mekanismer, at opretholde høje fotosyntetiske effektivitet og beskytte fra foto-oxidative skader forårsaget af overdreven lyset. En større lys-beskyttende proces i fotosyntetiske eukaryoter er høj energi quenching (q_E) af absorberet lyset, der forekommer som det vigtigste bidrag til den ikke-fotokemisk quenching (NPQ) under lys stress betingelser^{1,2 ,3}. De lette høst antenne komplekser (LHC) er involveret i reguleringen af excitation energi overførsel veje. Som reaktion på høje lys induceret lav pH i grønkornets lumen, antenne system skifter fra lyset høst tilstand til tilstanden quenching. Denne energi dissipative tilstand beskytter bannersystem (PS) og andre komplekser i tylakoid membran fra foto-oxidation. I fotosyntetiske eukaryoter, er q_E normalt forårsaget af to faktorer^1,2,3. En faktor er den specialiserede lys høst protein, der reagerer på den lave pH. PsbS protein inducerer q_E i højere planter⁴. LhcSRs⁵, moduleret af PsbS aktivitet, fremkalde q_E i grønalger⁶. Kiselalger besidder Lhcx-lignende proteiner, som strukturelt relateret til LHCSRs^7,8,9,10.

Den anden faktor af q_E er den xanthophyll cyklus hvor carotenoider antennen er omdannet til en foto-beskyttende form af de-epoxidation og vendt af epoxidation. I planter og grønalger konverteres violaxanthin til zeaxanthin. I kiselalger, er diadinoxanthin konverteret til diatoxanthin, som derefter korrelerer med omfanget af NPQ¹¹. Diatom lys høst antenne besidder nogle særheder, selv om det er evolutionær relateret til plante og alge LHCs. Skiftet fra lys høst til foto-beskyttelse er enormt hurtigt og NPQ kapacitet er højere sammenlignet med planter¹². Dette kan være en af grundene til hvorfor kiselalger er meget vellykket i forskellige økologiske nicher på en måde, som de er ansvarlige for op til 45% af det oceaniske netto primærproduktion¹³. Diatom lys høst systemer er derfor et interessant objekt af fotosyntese forskning.

Kiselalger, ligesom de centriske arter Cyclotella meneghiniana, besidder tylakoid iboende lys høst systemer opkaldt efter pigmenter de binde – fucoxanthin, klorofyl (chl) a og c, dermed FCP. lys høst proteiner, såsom FCPs, er indlejret i tylakoid membran system bestående af flere membran lag. Kiselalger danner bands af tre tylakoiderne. Dette kompleks situation gør det vanskeligt at studere dem på det molekylære niveau i tylakoid membran. Desuden, bidrager mange komponenter til reguleringen af lys høst (se ovenfor). Derfor, i mange tilgange, komplekser blev isoleret fra membranen bruge milde rengøringsmidler, som n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-Bettinas), som solubilize membranen men holde FCP komplekser intakt. Mange spektroskopiske undersøgelser blev udført ved hjælp af solubilized FCP for at undersøge intramolekylære energi overførsel^14,15,16,17. Denne tidligere tilgang var imidlertid begrænset, da forordningen af energioverførsel behov for excitonic interaktion med andre antenne komplekser eller bannersystem. Derfor, disse former for undersøgelser kan ikke foretages med solubilized komplekser fordi samspillet mellem komplekser er tabt.

En vigtig funktion i antenne forordning er “Molekylær fortrængning” af antenne og bannersystem i tylakoid membran¹⁸. Tidligere, en enkel tilgang blev udført for at simulere denne effekt in vitro-. Vaskemidlet blev fjernet, hvilket fører til tilfældige sammenlægning af antenne komplekser. Selv om nogle rimelig data er opnået ved denne tilgang^17,19, vaskemiddel fjernelse afspejler ikke situationen i vivo og har nogle begrænsninger, da komplekser ikke interagere i deres regelmæssige tertiær struktur.

Brug af Liposomer overvinder flere af de tidligere begrænsninger. Den tertiære struktur er stadig fuldt intakt. Liposom membran giver en kvasi indfødte miljø for antenne komplekser. Membranen adskiller indersiden af Liposom fra omgivelserne. Med disse midler giver Liposomer to reaktion rum for undersøgelser af ion og pH stigninger såvel som for transport processer. Yderligere, kan parametrene af ordningen for eksperimentel styres lettere for studier i tylakoid membran. Liposomer var allerede vist sig at være et udmærket redskab til at studere fotosyntetiske komplekser. En stor fokus i fortiden var på anlægget LHC hvor effekten af ændret lipid sammensætning blev testet på LHC II²⁰. I andre tilgange, protein-protein interaktion mellem forskellige LHC II var undersøgte²¹. Også, nogle undersøgelser i grønalger blev udført at beskriver spontan klyngedannelse mellem LHC²². I betragtning af betydningen af kiselalger for vandøkosystemer, forholdsvis få undersøgelser blev udført med antenne komplekser af kiselalger. To studier undersøgt antenne komplekser af den centreret Cyclotella meneghiniana, hvor klynger af FCP antenne²³ og lydhørhed af FCP til elektrokemiske gradienter²⁴ blev vist. Liposomer er således et fremragende værktøj til at studere diatom antenner og deres interaktion og forordning i næsten oprindelige betingelser. Liposomer er alsidige siden mange betingelser som lipid sammensætning, Liposom størrelse, protein tæthed og den omkringliggende vandige fase kan kontrolleres. Metoden kræver desuden lavt beløb af prøver. Den eksperimentelle system er robust og meget reproducerbare. Opdelingen i Liposomer giver mulighed for at studere pH og ion forløb, som er vigtige faktorer i reguleringen af antenne komplekser.

Her beskriver vi isolering af FCP antenne komplekser fra C. meneghiniana og deres inkorporering i Liposomer med naturlige tylakoid lipid sammensætning. Også, vi leverer eksemplarisk data for spektroskopiske karakterisering af solubilized FCP og sammenligne dem med FCP i Liposomer. Metoden opsummerer viden og standardiserede protokoller fremstillet af forbedringer af Gundermann og Büchel 2012²³, Natali et al. 2016²²og Ahmad og Dietzel 2017²⁴.

Figur 1: skematisk gengivelse af arbejdsprocessen. (1) henviser til punkt 1, som beskriver cellevækst, forstyrrelser og tylakoid isolation med følgende FCP adskillelse på saccharose tæthed gradienter; C. m. –Cyclotella meneghiniana celler. (2) udarbejdelse af naturlige tylakoid lipid blanding (MGDG, DGDG og SQDG) er beskrevet i stk. 2 og oprettelsen af lipid-vaskemiddel micelles med octylglycoside (OG). En defineret lipid-micelle størrelse opnås ved ekstrudering ved hjælp af membraner af defineret porestørrelse. FCP og lipid-micelles er samlet på en foruddefineret lipid: forhold mellem protein og vaske-og rengøringsmidler OG og β-Bettinas er fjernet via kontrollerede dialyse danner FCP proteoliposomes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.