JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
환경과학

Avaliação de saúde de peixes selvagens baseada em necropsia

Published: September 11, 2018
doi:
10.3791/57946
, , ,
1National Fish Health Research Laboratory, Leetown Science Center,U.S. Geological Survey, 2School of Natural Resources,West Virginia University

Summary

A saúde dos peixes selvagens pode ser usada como um indicador da saúde do ecossistema aquático. Avaliações de saúde baseados em necropsia peixe fornecem documentação de lesões ou anormalidades, dados utilizados para calcular os índices de condição, bem como a oportunidade de recolher os tecidos para avaliação microscópica, expressão gênica e outros mais aprofundada análises.

Abstract

Influências antropogénicas de aumento de nutrientes e contaminantes químicos, a alterações de habitat e mudanças climáticas, podem ter efeitos significativos sobre as populações de peixes. Efeitos adversos, monitorização, utilizando biomarcadores dos organismos ao nível molecular, podem ser usados para avaliar os efeitos cumulativos em peixes e outros organismos. Saúde de peixe tem sido usado em todo o mundo como um indicador da saúde do ecossistema aquático. Avaliação de saúde baseados em necropsia peixe fornece dados sobre índices anormalidades e lesões, parasitas, condição e organosomatic visíveis. Estes podem ser comparados por site, temporada e sexo, bem como temporalmente, para alterações no documento ao longo do tempo. Classificações de gravidade podem ser atribuídas a várias observações para calcular um índice de saúde de peixes para avaliação quantitativa mais. Uma desvantagem da avaliação baseada em necropsia é que é baseado em observações visuais e fatores de condição, que não são tão sensíveis como tecido e subcellular biomarcadores para efeitos subletais. Além disso, é raramente possível identificar causas ou fatores de risco associados com anormalidades observadas. Assim, por exemplo uma lesão elevada ou “tumor” no barbatanas, lábios ou na superfície do corpo pode ser uma neoplasia. No entanto, também pode ser uma resposta a um parasita, inflamação crônica ou hiperplasia de células normais em resposta a uma substância irritante. Por outro lado, neoplasias, certas parasitas, outros agentes infecciosos e muitas mudanças de tecido não são visíveis e então podem ser subestimadas. No entanto, durante a avaliação baseada na necropsia, sangue (plasma), tecidos para Histopatologia (patologia microscópica), genômica e outras análises moleculares e otólitos para envelhecimento podem ser coletados. Estas análises a jusante, juntamente com análises geoespaciais, avaliações de habitat, análises de qualidade e contaminantes de água podem todos ser importantes nas avaliações do ecossistema global.

Introduction

As atividades humanas têm inúmeros efeitos adversos em ambientes aquáticos. Os peixes habitam vários corpos de água que a população humana recria em e usa frequentemente como uma fonte de água potável e, portanto, são importantes indicadores da saúde do ambiente aquático. Peixes selvagens que vivem e se reproduzem em um determinado habitat são expostos ao longo de suas vidas para vários estressores incluindo patógenos, parasitas, má qualidade da água e contaminantes químicos. Milhares de produtos químicos entram nosso interior através de águas residuais industriais e humanas, águas pluviais urbanas/suburbanas e escoamento agrícola. Estas misturas complexas de substâncias químicas podem ter aditivos, sinérgicos ou efeitos antagônicos na expostos os organismos1,2,3. Além disso, outros estressores ambientais tais como elevada de nutrientes, temperatura elevada, baixo oxigênio dissolvido ou flutuações de pH pode exacerbar os efeitos de contaminantes químicos4,5. Estressores ambientais também podem influenciar os resultados de doenças infecciosas diretamente pelo aumento do número de agentes infecciosos6, aumentando a virulência dos patógenos oportunistas7 ou suprimindo a resposta imune e doença resistência do hospedeiro8,9,10. Por estas razões, existe uma crescente interesse em efeitos biológicos ou adversos monitorização11,12,13,14, utilizando peixes e outros organismos aquáticos para identificar populações e dos ecossistemas em risco.

Efeitos adversos monitoramento utiliza biomarcadores em vários níveis da organização, desde os organismos ao subcellular ou moleculares, identificar os efeitos subletais, que podem influenciar as populações e ser um indicativo da exposição a estressores diversos. Indicadores a nível de organismo incluem condições e anormalidades visíveis. Índices de condição com base no comprimento e peso são calculados para avaliar o bem-estar ou a adequação das populações de peixes. O mais comum é fatores de condição do Fulton (K) = (peso/comprimento3) 15. Outro indicador é a presença de anormalidades visíveis. Uma variedade de métodos usaram-se em estudos individuais e programas de monitorização para avaliar, documento e avaliar anormalidades visíveis. Avaliação com base apenas nas anomalias externas, ou seja, a proporção de indivíduos com doença, danos de barbatana, tumores e anomalias esqueléticas, é uma das métricas para o índice de Integridade biótica (IBI), que avalia a comunidade de saúde16. Uma avaliação semelhante denominada DELTs (deformidades, erosões, lesões, tumores) também tem sido utilizada para avaliar a saúde das comunidades de peixes17. No entanto, esses métodos apenas avaliam anormalidades visuais externas e internas não lesões ou indicadores de subletais precoce.

Avaliações baseadas em necropsia incluem observações externas e internas e permitam a medição dos índices de condição adicional. Índice indicam (peso do fígado peso/total) também tem sido usado como um indicador de aptidão ou reservas de energia15 para que um valor de índice mais alto indica o peixe mais saudável. No entanto, vários estudos têm mostrado que a hipertrofia ou um aumento no tamanho do fígado ocorre devido à exposição a contaminantes diversos, metabolizados pelo fígado18,19,20. Neste caso, um índice mais elevado seria indicativo de exposição a certas classes químicas. O índice de gonadossomática (peso do corpo do peso/total gônada) é outro índice de condição voltado para saúde reprodutiva21. As observações feitas durante a avaliação baseada na necropsia podem ser usadas para comparar a prevalência dos tipos de lesão individual ou percentagem de indivíduos normais. No entanto, eles também podem ser usados em um mais quantitativa saúde avaliação22,23.

A avaliação baseada em necropsia padronizada descrita aqui pode ser usada para aumentar a avaliação grosseiramente visível de várias maneiras dependendo as questà µ es a serem respondidas, conhecimentos e outros recursos disponíveis. Nossa abordagem de rotina é coletar dados biométricos (comprimento, peso, peso do fígado, peso gônada), sangue para análises do plasma/soro, documentos internos e externos visíveis anomalias, preservar peças de órgãos para análises microscópicas e coletar otólitos para análises de idade. A avaliação baseada em necropsia plus análise de idade e histopatologia de vários órgãos, permite o cálculo e a comparação de vários índices de condição, a prevalência de anormalidades visíveis, bem como as alterações microscópicas de tecido, por sexo, idade, local e período de amostragem. Coleções de tecido adicional podem ser feitas para muitas outras análises, incluindo microscopia eletrônica, bacteriologia, virologia, Parasitologia e concentrações químicas. Esses métodos também podem ser parte de análises aprofundadas mais usados para diagnosticar a causa das mortes de peixes24 ou mortalidade em cativeiro de peixes25. Métodos para coleta de tecido para duas análises adicionais, expressão gênica e análises imunes funcionais são ilustrados.

Protocol

Métodos descritos aqui foram aprovados pelo centro de ciência de Leetown institucional Cuidado Animal e Comitê de uso. 1. os peixes coleção Recolha o peixe vivo, com um mínimo de stress. Use o barco ou mochila bimestrais, gancho e linha ou redes. Segure o peixe em poços ao vivo ou gaseificadas recipientes até amostragem.Nota: A sociedade americana de pesca publicou uma série de guias para peixe recolha, manipulação e anestesia/eutanásia26,,27,28. Use luvas ao manusear o peixe. 2. peixe de necropsia Eutanásia em um peixe. Coloque o peixe em anestésico até odontódios movimento cessa e o peixe perde o equilíbrio. Depois de mais 2 – 10 minutos o peixe vai ser sacrificado; no entanto, também pode variar por espécie.Nota: O peixe pode ser sacrificado com um número de anestésicos (consulte a Tabela de materiais para mais comumente usado). O método de eutanásia dependerá das medições de laboratório que serão realizadas em tecidos coletados29. Medida de características biométricas. Pese o peixe para a grama mais próximo. Meça o comprimento do peixe ao milímetro mais próximo. Medir o comprimento total da ponta do focinho com a boca fechada até o fim da cauda quando comprimida juntos. Medir o comprimento de garfo do garfo na cauda até a ponta do focinho e o comprimento padrão da ponta do focinho à extremidade do corpo (início da cauda). Calcule o fator de condição usando a seguinte fórmula:Fator de condição = (peso total do corpo – peso gônada) / total de comprimento3.Nota: Peso da gônada é subtraído do peso total do corpo desde gônadas podem contribuir significativamente para o peso total do corpo, particularmente em peixes femininos prespawn. Obter uma amostra de sangue.Nota: Sangue mais comumente é retirado da veia caudal mas pode também ser retiradas a aorta dorsal ou por cardíaco punção30. Extrai uma amostra de sangue periférico de veia caudal com uma agulha de G 22 ou 23 em uma seringa de 1 a 5 mL, dependendo do tamanho do peixe. Insira a agulha anterior a caudal área abaixo da linha lateral (figura 1A e 1B). Direcione-a para cima até atingir a coluna vertebral e em seguida retirar um pouco. A veia é ventral da coluna sobrejacente.Nota: Se as manchas de sangue serão feitas ou soro é necessário, sem anticoagulante é usado. Na maioria dos casos, plasma será coletado e, portanto, um anticoagulante como a heparina de sódio, EDTA ou de lítio é usado para cobrir a agulha e seringa e é também no tubo de coleta de sangue (por exemplo, vacutainer). Retire a agulha e coloque em um recipiente de eliminação de objectos cortantes antes de colocar o sangue no tubo de coleta.Nota: Sangue pode ser realizada no gelo, mas dependendo de análises subsequentes deve ser centrifugada, logo que possível30. Se anormalidades nucleares ou diferenciais contagens de sangue serão avaliadas, imediatamente coloque uma gota de sangue em duplicado limpa vidro corrediças do microscópio. Volta um segundo deslize em um ângulo de 45° para a queda, que é então desenhada através da superfície por ação capilar. Deixe secar ao ar livre31. Centrifugar o sangue a 1.500-2.500 x g durante 15 min para sedimentos das células. Remover o plasma/soro com uma pipeta de transferência estéril, alíquota em frascos criogênicos e armazenar a-80 ° C. Figura 1 : Obtenção de uma amostra de sangue de um peixe. (A), A recentemente sacrificada peixe é colocado sobre o seu lado e a linha lateral localizado. (B), uma agulha é inserida ventral lateral linha (seta), angulada para cima até agulha toque a espinha dorsal. Então é um pouco retirado, e sucção iniciada para retirar o sangue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Realizar uma avaliação de saúde baseados em necropsia em cada peixe.Nota: Um número de publicações, ilustrando e descrever as lesões e anormalidades está disponíveis32,33,34,35. Documento de anomalias externas incluindo lesões na superfície do corpo e nadadeiras (Figura 2), olhos e brânquias (Figura 3), parasitas externos como sanguessugas (Figura 2D), larvas ou cistos metacercarial tremátodos (Figura 2D, 3B) e gill parasitas (Figura 3D). Documento tipo, localização e tamanho das anomalias observadas nas folhas de dados, bem como fotograficamente, se possível. Abra a cavidade abdominal (Figura 4A), usando uma tesoura de corte da região anal para o opérculo e removendo o retalho do músculo para expor os órgãos internos.Nota: Se o rim anterior será coletado para imunológico funcionar (consulte a etapa 5 abaixo) ou amostras coletadas para bacteriologia ou virologia, a superfície externa do corpo deve ser desinfectada com álcool 70% e as amostras devem ser obtidas antes da necropsia realizada. Se os tecidos só estão sendo usados para observações, análises de plasma e histopatologia de técnica estéril não é necessária. Documento internas anormalidades (Figura 4) incluindo descolorações gerais ou focais de vários órgãos (Figura 4B-4D), presença de levantou áreas (Figura 4E), cistos, parasitas e tamanho (anormalidades alargada, atrofiado). Figura 2 : Exemplos de lesões observaram na superfície do corpo e as barbatanas de peixes. (A), A pequena, ligeiramente erodida lesão (seta) na superfície lateral do corpo. (B) uma avermelhada áre (seta) envolvendo a superfície caudal do corpo. (C) Raised, pretas lesões (setas) na superfície do corpo e nadadeiras. (D) sanguessugas (seta branca) e pequenas manchas pretas (setas pretas) na nadadeira. Barra de escala = 3 mm. (E) A gerado, pálida, multilóbulos lesão (seta) na superfície do corpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Exemplos de lesões visíveis das brânquias e olhos de peixe. (A) A pale (seta) de área dentro da lente do olho. Barra de escala = 5 mm. (B) branco cistos (setas brancas) e pequenas manchas pretas (setas pretas), causadas por parasitas tremátodas sobre o opérculo cobrindo as brânquias (uma). Barra de escala = 1 cm. (C) uma pálida, erodida área (seta) sobre o gill (um). Barra de escala = 5 mm. (D) um peixe que foi removido mostrando parasitas (setas) anexado aos filamentos da brânquia. Barra de escala = 2 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Exemplos de necropsia e anormalidades internas de peixes. (A) durante uma necropsia o peixe é aberto (ao longo da seta branca) e um retalho de músculo (seta preta) removida para expor a gônada (a) e o baço, sendo mantido por fórceps e a tesoura. (B) Mottled hepática (a), testículos (b), intestino, rodeado por tecido adiposo gordura (c) e estômago (d). Barra de escala = 5 mm. (C) fígado (a) com uma área vermelha escura (seta), ovário (b) e intestinos (c). Barra de escala = 5 mm. (D) hepática com áreas descoloridas esverdeadas (setas). Barra de escala = 1 cm. (E) exemplo de um (a) normal e anormais (b) os testículos com criados nódulos. Barra de escala = 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Obter índice indicam (HSI). Remova o fígado, separando a artéria hepática e o tecido conjuntivo da extremidade anterior. Levante suavemente para fora enquanto aderências aparamento e outras conexões ao intestino e gordura adiposa. Tome cuidado para não perfurar a vesícula biliar. Pese o fígado.Nota: Alguns peixes, tais como os ciprinideos, não tem um fígado discreto mas prefiro hepático tecido enrolado os intestinos e outros órgãos. Para estas espécies, pode não ser possível obter pesos do fígado. Calcule o índice indicam (HSI) usando a fórmula:XI = peso de corpo do fígado peso/total Calcule o índice de gonadossomática. Remover as gônadas e pesá-lo. Calcule o índice gonadossomática (GSI), usando a fórmula:GSI = peso de corpo total/peso gônada 3. preservar os tecidos para patologia microscópica Nota: Um número de fixadores, incluindo 10% de formalina tamponada neutro e Z-fix, um fixador de formalina-baseado com zinco, pode ser usado para preservação de tecido no campo. O último é preferido se podem ser utilizados métodos tais como a hibridação in situ ou anticorpos fluorescentes. Cuidadosamente corte mas não retirar amostras de tecido. Manter peças de tecido individuais < 2 cm de tamanho e < 5 mm de espessura para a fixação adequada. Como regra geral, use aproximadamente 10x mais fixador em volume do que o tecido para boa conservação. Coloque todas as amostras de tecido de um peixe no mesmo recipiente de tamanho apropriado, dependendo do tamanho do peixe sendo amostrado estanques. Coloque pedaços de qualquer anormalidade externa no recipiente fixador. Além disso, inclua um pedaço adjacente de tecido normal.Nota: Impróprio manipulação como compressão ou outros danos mecânicos, longa exposição ao ar ou a luz solar e congelamento podem causar artefatos. Corte de pelo menos cinco peças de 3 – 4 mm espessura do fígado de várias regiões e introduzir no recipiente do fixador. Inclua áreas normais e anormais, se observados. Dependendo do tamanho, coloque uma gônada inteira ou vários pedaços ao longo de uma gônada dentro do recipiente do fixador. Coloque ou órgãos inteiros, se pequena ou pedaços de todos os outros órgãos (baço, rim anterior e posterior, brânquias, coração, intestino e estômago) no recipiente fixador. Se o tecido anormal for observado, preserve um pedaço adjacente de tecido normal também. 4. Remova os otólitos para análises de idade Nota: A idade pode ser uma variável importante em estudos de saúde/doença dos peixes peixes. Enquanto um número de estruturas, incluindo escalas e espinhos, têm sido utilizado para determinação da idade, a maioria dos estudos comparando estruturas descobriram os otólitos para dar os melhores resultados de36,37. Peixes teleósteos têm três pares de otólitos – lapillus, sagitta e asteriscus. Geralmente, os otólitos sagitais ou lapillus são coletados para o envelhecimento, embora que podem variar conforme a espécie. Técnicas de remoção e envelhecimento têm sido descritas anteriormente38. Corte através do istmo de gill e dobre a cabeça para trás. Tira fora muscular e conjuntivo tecido ao redor as partes inferiores do neurocrânio para localizar prootic bolhas, uma área óssea levantada. Marcar ou cortar com cortadores de osso e crack para expor os otólitos. Eles podem ser vistos a olho nu. Coloque otólitos em um frasco rotulado ou um envelope de moeda e armazenar à temperatura ambiente até analisados por idade, contando os anéis ou incrementos de38. Se colocando em um frasco, abrir a tampa uma vez voltou ao laboratório e permitir completamente seco antes do armazenamento. Figura 5 : Remoção de otólitos. (A) o istmo é cortado e o tecido conjuntivo e músculo puxado para expor a base da coluna vertebral e neurospinal área. (B), o osso está rachado para expor os otólitos. (C) Lapillar otólitos são removidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5. obter tecido para ensaios de função imunológica Nota: O rim anterior é o grande órgão hematopoiético, a fonte de linfócitos e macrófagos para ensaios funcionais e deve ser removido assepticamente se células vão ser cultivadas para ensaios funcionais, tais como mitogênese, fagocíticas e capacidade de abate de os macrófagos39,40. Pulverize a superfície externa do peixe com etanol a 70%. Use tesoura estéril, um bisturi e pinça para abrir a cavidade abdominal e remover o tecido renal anterior, que é um órgão de vermelho escuro localizado à frente da bexiga natatória. Coloca a amostra do rim anterior em mídia (por exemplo, Leibovitz L-15) para manter as células vivas. Homogeneizar as amostras de rim com um moedor de tecido à mão estéril (por exemplo, Tenbroeck tecido moedor) em suspensões celulares simples. Espere o gelo molhado até que voltou para o laboratório. 6. preservar o tecido para análises de ácido nucleico Nota: Se a jusante análise molecular será realizado, tais como a expressão gênica usando transcrição abundância41 ou quantitativo PCR42 (reação de cadeia de polimerase), coloque os pedaços de tecido para ser avaliado em um conservante adequado ( por exemplo,, solução de estabilização RNAlater) logo que possível. Para preservação de RNA, coloque duas ou três pequenas (2 a 3 mm) peças em conservante adequado na proporção de 10:1 do conservante volume ao tecido.Nota: Amostras devem ser protegidas da luz solar ou calor excessivo e transportadas no gelo molhado. Para a preservação do DNA, coloque dois ou três pequenos pedaços de tecido em etanol a 95% (10:1 ao tecido em volume de etanol). Em seguida, mantenha as amostras no gelo molhado e em seguida, armazenar a-20 ° C.

Representative Results

Grandes lagos áreas de preocupação (AOC) são áreas geográficas que foram designadas devido a lesões de vários usos benéficos. Dentre as deficiências de uso benéfico (BUIs) em muitos AOC é que os tumores de peixe ou outras deformidades. Milhões de dólares foram gastos para reparação e restauração de cada uma dessas áreas para exclusão das listas o diversos BUIs e, finalmente, a AOC43. Os critérios de saída o tumor de peixe que bui difere de estado para estado (ver epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf e dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); no entanto, como observado nos documentos de saída, há uma exigência para determinar a prevalência de tumores no fígado e em alguns casos tumores de pele. Em muitos casos, a prevalência é comparada a um site de referência não-AOC. O tumor de peixe BUI foi avaliado em três AOCs (St. Louis River, Rio de Milwaukee e Rio Sheboygan) e um site de referência não-AOC (Rio Kewaunee) em lagos Superior e o Michigan, utilizando uma avaliação baseada em necropsia de ventosa branca (Catostomus commersonii ), seguido por patologia microscópica da pele e do tecido do fígado. Peixes foram coletadas dos rios Milwaukee, Sheboygan e Kewaunee em 2012 e 201344 e do rio St. Louis em 2015 (dados não publicados). Duzentos ventosas brancas foram avaliadas a partir de Milwaukee, Kewaunee e St. Louis e 193 de Sheboygan. Por definição, um tumor pode ser de qualquer área de inchaço ou levantada, embora geralmente considera-se que um inchaço causado por um crescimento anormal de tecido com células anormais ou uma neoplasia benigna ou maligna. Sucker branco coletado de todos os sites exibiu uma variedade de lesões externas levantadas, incluindo manchas brancas pequenas, discretas, maiores áreas brancas, lesões mucoide ligeiramente levantadas e multilóbulos áreas levantadas na superfície do corpo e lábios (Figura 6). Peixes foram pesados e medidos para obter um fator de condição, anormalidades externas e internas foram documentadas e tecido da pele e fígado foi coletado para histopatologia. Figura 6 : Lesões de pele levantadas observaram otário branco da região dos grandes lagos. (A) uma discreta mancha branca na superfície do corpo. Barra de escala = 5 mm. (B) A ligeiramente levantada mucoides (setas) e lesões multilóbulos (uma) na superfície posterior do corpo. Barra de escala = 1 cm. (C) A grande multilóbulos lesão na superfície do corpo. Barra de escala = 1 cm. (D) numerosas lesões múltiplos lóbulos na boca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O percentual de peixes com tumores externos ou levantada descoloridos áreas variou de 15,5% em St. Louis COA para 58,0% em Milwaukee COA. Em geral, as discretas manchas brancas eram a lesão menos comum visual enquanto o lábio multilóbulos e lesões superficiais de corpo eram mais comuns. O número de peixes com nódulos de fígado observáveis foi baixo, variando de 1,5% em Kewaunee e St. Louis para 2,5% em Milwaukee (tabela 1). Rios e ano amostrado Lesões visíveis Kewaunee 2013 St. Louis 2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013 Discretas manchas brancas 16 3 3.1 5 Mucoides 20 9.5 9.8 30.5 Multilóbulos 22.5 3 29.5 40 Total arrecadado pele anormalidadesum 46 15.5 38,3 58 Nódulos visíveis de fígado 1.5 1.5 1.6 2.5 um Número total de peixes com lesões levantadas. Alguns peixes tinham vários tipos de anomalias. Tabela 1: Necropsia com base em observações de ventosa branca coletadas em áreas de grandes lagos de preocupação e um Site de referência (Rio Kewaunee), apresentadas como uma porcentagem.Exame visual pode ser usado para documentar o percentual de peixes com várias anormalidades. No entanto, para definitivamente diagnosticar a presença e o tipo de neoplasia, os tecidos devem ser examinados microscopicamente (histopatologia). Ao exame microscópico, verificou-se que nem todas as lesões levantadas eram neoplásicas. Muitos as discretas manchas brancas e as lesões mucoide, particularmente em Kewaunee, eram lesões hiperplásicas, ao invés de neoplasia (tabela 2). Além disso, em Kewaunee e St. Louis, todos os tumores de pele observados foram papilomas benignas. Em Sheboygan e Milwaukee tanto papilomas e carcinomas espinocelulares, tumores malignos de pele, foram observadas (tabela 2). Rios amostrados Tipo de neoplasia Kewaunee 2013 St. Louis 2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013 Papiloma 21 5.2 30.5 37.5 Carcinoma de células escamosas 0 0 2.1 10.5 Neoplasias de pele total 21 5.2 32,6 48 Ducto biliar Neoplasiasum 2.5 4 6.2 9.5 Neoplasias de células hepáticasb 1 0 2.1 8 Neoplasias Hepáticas total 3.5 4 8.3 15,0c um Inclui cholangioma e Colangiocarcinoma b Inclui a célula hepática adenoma e carcinoma de células hepáticas c Alguns peixes tinham tanto o ducto biliar e neoplasias hepáticas Tabela 2: Microscopicamente verificadas lesões neoplásicas de ventosa branca coletadas em áreas de grandes lagos de preocupação e um Site de referência (Rio Kewaunee), apresentadas como uma porcentagem.A análise histopatológica também identificou tumores no fígado que não foram identificados pela observação visual. Enquanto apenas 1,5% dos peixes coletados de Kewaunee e St. Louis tinha nódulos visíveis de fígado (tabela 1), 3,5% e 4,0%, respectivamente, microscopicamente identificou Neoplasias (tabela 2). A maior diferença foi vista em Sheboygan (1,6% visível contra 8,3% microscópicos) e Milwaukee (2,5% visível contra 15,0% microscópicos). Exame microscópico também fornece uma diferenciação de Neoplasias do ducto biliar contra a origem da célula hepática (tabela 2) e benigno contra tumores malignos.

Discussion

A avaliação baseada em necropsia de saúde de peixe pode ser utilizada em qualquer espécie de peixe para que o investigador tem um entendimento da aparência normal das estruturas externas e internas. Usar uma abordagem padronizada permite comparações entre sites e de espécies, bem como as alterações sazonais e temporais em uma população. Os resultados podem ser usados para identificar os efeitos associados com ponto e nonpoint fontes de contaminantes e informar ações de gerenciamento. Ele também pode ser usado para acompanhar melhorias após ações de gerenciamento são iniciadas. A metodologia pode ser modificada para aumentar a documentação do visuais externas anormalidades em uma variedade de maneiras. Avaliações, baseadas apenas em observações visuais, podem ser letal, relativamente barato e dados podem ser gerados rapidamente para um grande número de indivíduos. Consequentemente, eles podem ser úteis para avaliações exploratórias ou iniciais, para monitorar a mudança ao longo do tempo ou em combinação com outros indicadores. Se o comprimento e peso dos peixes são medidos durante observações visuais, o fator de condição também pode ser calculado. Embora as avaliações com base apenas na observação visual não fornecem informações sobre a causa ou fatores de risco associados, tendências de longo prazo de certas anormalidades de pele45 e parâmetros biométricos46 indicaram melhora em algumas áreas associado com melhorias de qualidade de água.

A avaliação baseada em necropsia fornece mais informações como órgãos internos também são examinados e outros factores de condição como índice de indicam e gonadossomática podem ser calculados. Goede e Barton22 desenvolveram um método de necropsia de campo que incluiu parâmetros do sangue, fatores biométricos, a percentagem de anormalidades e valores de índice para anormalidades específicas. Um refinamento do método incluído uma classificação de gravidade para algumas variáveis que o permitido para o cálculo de um índice de avaliação de saúde que poderia ser comparados estatisticamente23. Este índice de avaliação de saúde tem sido utilizado no site regional comparações23,,47,48 e em combinação com outros indicadores biológicos incluindo o plasma e análises histopatológicas em os E.U. Geological Do levantamento Biomonitoramento de estado ambiental e programa de tendências avaliando os efeitos potenciais de exposição contaminante em grandes rios em todo o país49,50,51. Um índice de doenças de peixes com base em visíveis externamente doenças e parasitas, neoplasias hepáticas visíveis e outros histopatologicamente detectaram lesões hepáticas foi desenvolvido e usado extensivamente no mar do Norte, mar Báltico e Islândia. Este índice foi encontrado para ser uma ferramenta importante como um ecossistema saúde indicador52.

Existem alguns fatores críticos na condução da avaliação baseada em necropsia em peixes. Primeiro, as avaliações devem ser realizadas em peixes imediatamente após a morte. Alterações na cor do órgão e consistência podem ocorrer razoavelmente rapidamente após a morte. Além disso, alguns parasitas podem deixar o anfitrião logo após a morte. Em segundo lugar, é importante saber o que é normal para a espécie de interesse. Por exemplo, alguns peixes normalmente têm gordos e consequentemente, pálido fígados, enquanto para a maioria das espécies, um fígado pálido seria anormal. Também é importante reconhecer as mudanças sazonais que ocorrem naturalmente. Alguns peixes vão ter alterações de cor ou desenvolvem tubérculos de reprodução durante a época de desova.

As limitações da avaliação baseada em necropsia como método de avaliação de saúde de peixes incluem a incapacidade de identificar 1) consistentemente a “causa” de lesões específicas e 2) identificar os efeitos que podem não ser visíveis a olho nu. Estas desvantagens podem ser superadas com a adição de histopatologia, identificação cultural ou molecular de patógenos e parasitas e expressão gênica. Por exemplo, um “tumor” ou lesão elevada (inchaço) pode ser neoplasia real ou pode ser um parasita, inflamação, edema ou hiperplasia (aumento no número de células normais), causada por exposição a substâncias químicas, agentes infecciosos ou outros irritantes. Conforme os resultados representativos, diagnóstico de neoplasia ou tumor definitivo requer patologia microscópica para identificar o tipo de lesão e a gravidade (ou seja, benignas ou malignas). Avaliação de trouxa branca externa “tumores” pela observação visual superestimou a prevalência, particularmente no local de referência. Muitas das lesões levantadas não eram Neoplasias mas prefiro hiperplásicas lesões. Atualmente não se sabe se essas lesões hiperplásicas são pré-neoplásicas. Por outro lado, a observação dos nódulos levantadas no fígado significativamente subestimado a prevalência de neoplasias hepáticas. Daí, coleção de tecidos para patologia microscópica foi necessária abordar adequadamente o potencial de saída.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo ecossistemas do US Geological Survey (ambientes de Chesapeake Bay e da pesca) e programas de saúde ambiental (biologia de contaminantes) e o departamento de recursos naturais de West Virginia. Uso de nomes comerciais para fins de identificação apenas e não implica o endosso pelo governo dos EUA.

Materials

Folding tables Any
Folding chairs Any
Dissecting boards Any
Measuring board (in mm increments) Any
Battery powered scale (in gm) for fish weight Any
Battery powered scale (in mg) for organ weights Any
Dissecting forceps Any
Bone cutters Any
Scalpel and blades Any
Disposable gloves Any
Buckets Any
Leak-proof Nalgene bottles (250 ml) ThermoFischer Scientific 02-924-5C
Vacutainer tubes with sodium heparin ThermoFischer Scientific 02-689-6 For blood collection
Disposable  3 ml syringes with 23 gauge needle ThermoFischer Scientific 14-826-11
1 – 2ml cryovials Any Used for plasma and RNAlater samples
Invitrogen RNAlater Stabilization solution ThermoFischer Scientific AM7021
Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative Anatech LTD SKU-174
Tricaine-S (MS-222) Syndel USA fish anesthetic
Coin Envelopes Any for otoliths
Pencils and pens Any
70% alcohol Any
Data sheets Any
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
  2. Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
  3. Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" – eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
  4. Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
  5. Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
  6. Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
  7. Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
  8. Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
  9. Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
  10. Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
  11. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
  12. Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
  13. Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
  14. Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
  15. Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
  16. Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
  17. Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T., Simon, I. n. T. P. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. , 225-246 (1999).
  18. Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
  19. Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
  20. Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
  21. Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
  22. Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
  23. Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
  24. Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
  25. Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
  26. . American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , (2004).
  27. Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. . Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , (2009).
  28. Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. . Fisheries Techniques, third edition. , 1009 (2013).
  29. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
  30. Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
  31. Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film – a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
  32. Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
  33. Kane, A. S. . Descriptive guide to observing fish lesions. , (2005).
  34. Rafferty, S. D., Grazio, J. . Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , (2018).
  35. . European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , (2018).
  36. Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
  37. Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
  38. Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H., Stevenson, D. K., Campana, S. E. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. 117, 19-57 (1992).
  39. Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5′-bromo-2′-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
  40. Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
  41. Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology – Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
  42. Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
  43. Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
  44. Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
  45. Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
  46. Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality – data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
  47. Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
  48. Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
  49. Blazer, V. S., Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. , 18-21 (2000).
  50. Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
  51. Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
  52. Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).

Tags

NecropsyWild Fish Health AssessmentFish HealthStressorsAbnormalitiesBlood CollectionHistopathologyOtolithImmune FunctionGene ExpressionStandardized EvaluationFish Necropsy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Blazer, V. S., Walsh, H. L., Braham, R. P., Smith, C. Necropsy-based Wild Fish Health Assessment. J. Vis. Exp. (139), e57946, doi:10.3791/57946 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image