Изоляция артериол сетчатки для исследования физиологии клетки Ex Vivo
1Centre for Experimental Medicine,Queen’s University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education),Queen’s University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy,Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences,Queen’s University of Belfast
Summary
Эта рукопись описывает простой протокол для изоляции артериол от сетчатки крыс, который может использоваться в электрофизиологических, кальция изображений и давления миография исследований.
Abstract
Сетчатка является весьма метаболически активные ткани, которая требует существенной кровоснабжение. Сетчатки циркуляции поддерживает внутренний сетчатки, в то время как хориоидальные сосуды снабжения фоторецепторов. Изменения сетчатки перфузии способствуют многочисленные зрение угрожая расстройств, включая диабетической ретинопатии, глаукомы и сетчатки филиал окклюзии вен. Понимание молекулярных механизмов, участвующих в элементе потока крови через сетчатки и как они изменяются при глазной болезни может привести к выявлению новых мишеней для лечения этих условий. Артериолы сетчатки являются основными сопротивление сосудов сетчатки и следовательно, играют ключевую роль в регуляции гемодинамики сетчатки через изменения в Люминал диаметр. В последние годы мы разработали методы для изоляции артериол от сетчатки крыс, которые подходят для широкого спектра приложений, включая исследования физиологии клетки. Этот препарат уже начали приносить новый взгляд на как поток крови контролируется в сетчатке и позволило нам выявить некоторые из ключевых изменений, которые происходят во время глазных заболеваний. В этой статье мы описать методы для изоляции артериол сетчатки крыс и включить протоколы для их использования в патч зажим электрофизиологии, кальция изображений и давление миография исследований. Эти суда подлежат также для использования в ПЦР-, Западный blotting и иммуногистохимия-на основе исследования.
Introduction
Понимание, как поток крови контролируется в сетчатке является важной задачей, так как ненормальные кровотока было вовлечено в патогенезе различных зрение угрожая заболевания сетчатки1,2,3, 4. Сетчатки циркуляции, которая поставляет внутреннюю сетчатки нейронов и глиальных клеток, имеет договоренность конец артерии, со всеми из крови от сетчатки артерий и артериол, проходящей через капилляров сетчатки венулы и, наконец, Вены5. Кровообращения в сетчатке регулируется тон сетчатки артерий и артериол, а также сократительная активность pericytes, расположенных на стенках капилляров сетчатки и пост капиллярного венулы6,7, 8. контроль сетчатки сосудистого тонуса является сложным и модулируется широкий спектр материалов из системы кровообращения и окружающие ткани сетчатки, включая газов крови, циркулирующей молекул и гормонов, и высвобождение вазоактивных веществ от сетчатки сосудистого эндотелия и macroglia9,10,11. Артериолы сетчатки являются веточек артерий сетчатки и состоят из одного слоя клеток сосудистой гладкой мускулатуры и внутренней оболочки продольно расположенных эндотелиальных клеток12,13, 14. эти сосуды формируют главный сайт сосудистого сопротивления в пределах сетчатки циркуляции и поэтому играют важную роль в местные управления сетчатки кровотока. Артериолы сетчатки регулировать капиллярного кровотока в сетчатке, расширяя или сжимает их Люминал диаметр, при посредничестве изменения в сосудистой гладкой мускулатуры сократимости10,15,16. Понимание молекулярных механизмов, через который сетчатки, регулировать артериол сетчатки перфузии поэтому требует подготовки где артериол гладкомышечные клетки могут быть доступны и учился в условиях как можно ближе к физиологической как можно скорее.
Ex vivo препараты изолированных сетчатки сосудов обеспечивают доступ к сосудистой гладких мышечных клеток, по-прежнему сохраняя их функциональности и совместимости с базовой эндотелия. Большинство исследований на сегодняшний день использование изолированных судов были сосредоточены на больших говядины или свинины артериальных сосудов (60-150 мкм). Это может быть установлен в коммерчески доступных проволоки или давления myograph систем, позволяющих фармакологических допроса сосудистой гладкой мышечной клетки сократительной механизмы17,18. Такие препараты внесли наши знания физиологии сетчатки сосудов при нормальных условиях. Несколько исследований использовали артериол сетчатки, изолированных от мелких лабораторных животных как их меньшего диаметра (~ 8-45 мкм) предотвращает их использование в обычных миография систем19,20,21,22. Важным преимуществом, однако, с помощью судов от мелких лабораторных животных является широкая доступность модели заболеванием генетически модифицированные, трансгенных и сетчатки. Мелких лабораторных животных, также более сговорчивым в vivo исследований вмешательства.
Здесь мы опишем простой протоколы для изоляции и cannulating сетчатки крыс артериол для давления миография экспериментов. CA2 + визуализации электрофизиологии протоколы и с помощью этих судов также подробно. Эти дополнительные может обеспечить понимание регулирования сократимости гладких мышц сосудов и кровообращения в сетчатке.
Protocol
Все эксперименты, описанные здесь были выполнены в соответствии с руководящими принципами, содержащимися в Великобритании животных (научные процедуры) акт 1986 года и были одобрены королевы университета Белфаста животных и этической экспертизой. 1. изоляция артериол сетчатки Примечание: Следующий протокол используется для изоляции артериол сетчатки. Этот метод оптимизирован для артериол сетчатки крыс, но может быть использован с мыши сетчатки. Выход судов, однако, ниже, при использовании мыши. Составляют раствор низкой Ca2 + содержащие Hanks’ (ЛЦП), как показано в таблице 1.Примечание: Это решение может храниться до 3 дней при температуре 4 ° C (при использовании хранимых LCH, убедитесь, что он уравновешивает до комнатной температуры и рН правильно перед использованием). Соберите следующее оборудование до коллекции тканей для обеспечения быстрого microdissection retinas: зубчатые щипцы изогнутые ножницы, рассечение блюдо (силикон покрытием Петри), единого обрезная лезвие, 2 комплекта щипцы (тупой) 1 стакан пипетка Пастера (огонь отполированы до гладкой, но не узкий наконечник), 1 одноразовые пластиковые пипетки (с наконечником, обрезаны от увеличить отверстие в ~ 5-7 мм), 1 стакан раунд дно пробирки (5 мл) и держатель. Декант приблизительно 50 мл LCH в стеклянный стакан и подготовить второй стакан декантировать сточных жидкостей.Примечание: Смотрите Таблицу материалы для спецификации и производитель деталей. Усыпить крыса, использование CO2 следуют сердечной прокол для exsanguinate (Избегайте шейки матки вывих или сотрясения, как они могут повредить кровеносные сосуды в глазах). Убрать веки с зубчатыми щипцами, а затем использовать изогнутые ножницы, чтобы вырезать вокруг орбитальной мышцы и через зрительный нерв. Аккуратно извлеките глаз с орбиты, заботясь, чтобы прорваться через любые оставшиеся вложения с ножницами. Место глаза, погружен в раствор LCH на вскрытие блюдо (глаза может перевозиться на льду в растворе LCH при необходимости). Использовать один набор тупым щипцы для закрепления глаз на блюдо, удерживая орбитальной мышцы вложения или зрительного нерва; Убедитесь, что точка закрепления как можно ближе к склеры стабилизировать глаз. С помощью лезвия, прорваться через роговицу вдоль Серрата Ора и удалить объектив, осторожно нажав на склеру пинцетом. Вырежьте глаз Кубок в половине симметрично через диск зрительного нерва. С помощью закрыт щипцами осторожно «кисть», сетчатки из двух половинок наглазник, заботясь, чтобы удалить все оставшиеся вложения на диск зрительного нерва. Повторите процесс с второй глаз и передачи расчлененных сетчатки в пробирки с помощью пластиковых дозаторов и небольшой падение LCH среды. С помощью пластиковых дозаторов заполнить пробирку с LCH на ~ 5 мл и позволяют сетчатки оседают на дно. Стирать ткани примерно 3 раза, удалив ~ 4 мл раствора из трубки и добавить свежие LCH, используя пластиковые пипетки. При необходимости, удалите посторонние ткани, такие как отлагательное связки, стекловидное тело и волосы. Вымойте внутри стекла Пастер пипетки (полированный наконечник) с LCH предотвратить ткани от прилипания к пипеткой. Используя же пипетку, удалите примерно 4 мл раствора из пробирки. Затем добавьте примерно 2 мл свежего LCH. Аккуратно отделить (нарезанных) сетчатки, опираясь на ткани через кончик стекла Пипетка медленно и высылать содержимое в пробирки. Обратите внимание, не пытаться ввести пузыри на данном этапе. Повторите шаг 1.10 до тех пор, пока retinas разобран до размера примерно 2-3 мм2. Вымойте внутри пипеткой с примерно 2 мл LCH и высылать это в пробирки. Разрешить содержимое оседают на дно более 5-10 мин. Повторите процесс Тритурация изложенные в 1.10-1.12 с немного больше силы до тех пор, пока кусочки ткани, примерно 1 мм2 в размер. Опять же позволяют ткани соглашаться на 5-10 мин. Повторите шаги 1.10-1.12 в третий раз с большей силой до тех пор, пока содержание полной гомогенизации и остаются не части сетчатки (решение должно стать Млечный возникновение).Примечание: Этот метод даст до 8 arteriolare сегментов (относительно свободные окружающего neuropile и некоторыми филиалами, оставшихся нетронутыми) в изоляции, измерения 8-45 мкм в диаметре и 200-2500 мкм в длину. Передавать небольшое количество изолировать в камеру физиологического запись или добавить флуоресцентных красителей для измерения концентрации внутриклеточного Ca2 + ([Ca2 +]i; см. раздел 3). Утилизация остатков глаза чашки и решения удалены во время процесса изоляции в соответствии с местными правилами обработки отходов животноводства.Примечание: Хотя это рекомендуется экспериментировать на суда сразу же после изоляции, излишки изолировать может храниться при температуре 4 ° C до 8 ч. 2. артериол давление миография Примечание: Артериол давления миография осуществляется следующим с использованием оборудования, подробно изложены в Рисунок 1A, B и Таблица материалов. Передачи Алиготе сетчатки судно огневки (1-2 мл; изолированы в соответствии с разделом 1) в камеру физиологического записи (частично заполнены с номинально Ca2 +бесплатные Hanks решение; 0Ca2 + Hanks’; см. таблицу 1) смонтированы на сцене инвертированный микроскоп. Оставьте судов поселиться в нижней части камеры записи по крайней мере 5 минут до экспериментов. Визуально проверять через запись камеры для выявления артериол > 200 мкм в длину и обладающие открытый конец, через который можно cannulated судно (идентификация типа судна дополнительно изучить в разделе результаты). Положение судна в центре поля зрения. Если нет подходящих судов, передачи другой Алиготе судна огневки в записи камеру согласно шагу 2.1. Якорь один конец судна с помощью тонкой щипцы и небольшой Вольфрам проволока скольжения (диаметр 75 мкм и ~ 2-4 мм в длину) помещен над судна (см. Рисунок 1 c(i)). Для этого держите провод в щипцы и найдите щипцы выше запись камеры. Определить соответствующие тени щипцы под микроскопом, опустите щипцы в ванну, до тех пор, пока проволока становится очевидной. Наведите судна примерно 200 мкм от открытого конца провода и поместите провод перпендикулярно длинной оси судна.Примечание: Вес Вольфрамные проволоки достаточно, чтобы загородить судна дистально остановка потока Люминал содержимого при катетеризации и подпора. Переместите противовоспали в подходящее место в зале записи, таким образом, что он лежит горизонтально через ванну с открытым концом в соответствии с наддувом канюля (см. Рисунок 1 c(ii-iv)). Сделать это, мягко подталкивая наложения Вольфрам проволока скольжения с дополнительной секции провода, проводимых в рамках щипцами; не прикасайтесь артериолы, как он будет необратимо придерживаться щипцы. При необходимости (для сегментов длиной артериолы), добавьте дополнительные Вольфрам проволока скользит над судном, таким образом, что расстояние между окклюзии и открытые концы судна составляет не более 200 мкм; Это помогает предотвратить артериолы, перемещается из поля зрения на наддув. Если судно имеет все боковые ветви, они также должны быть закрыта с дополнительным Вольфрам проволока скользит. Если филиал стороне не может быть закрыта отказаться от судна. Perfuse камера с 0Ca2 + Hanks при 37 ° C для удаления посторонних ткани сетчатки и в теплой ванне для физиологических температур.Примечание: Стандартная ванна самотечных перфузии и в линии нагреватель система может использоваться для этой цели (см. рис. 1A). 0Ca2 + Hanks используется для облегчения процедуры катетеризации, после удаления внешних Ca2 + гарантирует, что остаются расширенные артериол. Изготовить наддув канюли из капилляров filamented боросиликатное стекло (наконечник диаметром ~ 3-10 мкм в зависимости от диаметра судна быть канюлированной; небольших судов требуют более узкий канюли; см. Таблицу материалы) с использованием Съемник микроэлектродные и обратно заливка раствором 0Ca2 + Hanks’. Убедитесь, что хвостовик катетер осторожно конус к кончику для облегчения катетеризации. Смонтировать канюли в пипетку держатель придает шприц 10 мл через соединитель Y и 3-way кран; Это используется для давление системы, давление, записываемого с помощью манометра прилагается к другой стороне руку Y-разъема (см. рис. 1B).Примечание: Пипетки «помощником» требуется для оказания помощи в процессе катетеризации. Изготовить пипетку из боросиликатного стекла капиллярного вытащил на микроэлектродные съемник наконечник диаметром 0,5 – 2 мкм. сильно огонь польский пипетки (часто до закрытия) с помощью microforge. Осторожно поместите дозатор вспомогательный под прямым углом к оси длиной судна близко к открытый конец с помощью 3-оси механический манипулятор (см. рис. 1 d). Позиции вспомогательный пипетки, чуть выше судно, но не касаясь его. Положение катетеризации пипетку в открытом конце судна (см. Рисунок 1 d и 2а(i)) с помощью тонкой микроманипулятор; Расположите наконечник непосредственно примыкает к церемонии открытия, как начисленных, регулируя плоскость фокуса на микроскопе (на 20 X). Когда оба конца судна и кончик канюля находятся в центре внимания в то же время, правильно канюли для катетеризации (см. рис. 2а(ii)). Заранее наддув канюли в отверстие судна с помощью оси управления тонкой микроманипулятор (см. рис. 2а(iii)). Оценки успех катетеризации, перемещая канюля вдоль оси y. Если катетер остается внутри судна это успешно канюлированной (см. рисунок 2A(iv)). Если канюлю перемещается вне судна, канюли, скорее всего, быть выше судна; Если это так, повторите шаг 2.10-2.11 с канюля на нижней плоскости в оси z. После успешного катетеризации аккуратно опустите вспомогательный пипетки на судно сдерживать артериолы. Руководство артериол стены над наддув канюля с помощником пипеткой, в то же время как расширенный катетеризации пипеткой дальше в просвет сосуда на расстоянии примерно 30-50 мкм (см. рисунок 2A(v, vi)).Примечание: Эта процедура требует синхронный, управляемый движение обоих манипуляторов (вспомогательный пипеткой направлении канюли, хотя канюли переходит в просвет сосуда) и потребует обширной практики для достижения высокий уровень успеха. Изменить решение, Ванна для нормальной Хэнкс содержащие 2 мм Ca2 + (см. таблицу 1) при 37 ° C. Обычно это вызывает небольшое сужение артериолы и формирование герметичное уплотнение вокруг наддув канюли. Вспомогательный пипеткой затем могут быть перемещены от судна. Разрешить герметичное уплотнение для разработки на 15 мин вид судна с помощью USB камеры (и программное обеспечение приобретения изображений) прилагается к микроскопу и настроить фокус Увеличить контраст между границ судна и внешней и внутрипросветная пространства (см. Рисунок 2B). Изображение корабля на 0.5 – 5 кадров/сек. После 1 мин записи на 0 мм рт.ст., увеличить давление внутрипросветная до нужного уровня, закрыв кран 3-полосная придает наддув канюля (см. рис. 1B) и применить небольшое количество положительным давлением к системе через шприц. Наблюдать изменения на манометр давления.Примечание: Давление могут добавляться в шаг мудрым моды до 100 мм рт.ст, или одному из значений например 40 мм рт.ст, (аппроксимации артериол сетчатки давления в естественных условиях)23. Судно должно быстро расширяются, подтверждающее успешный катетеризации. Обратите внимание, что давление индуцированной вазоконстрикция (т.е., миогенных ответ) будет впоследствии разработать в течение 15 мин, но из-за небольшого размера этих судов, это не всегда возможно визуально обнаружить. Внимательно следить за судно во время первоначального подпора для очевидных утечки. Источники утечки могут инициироваться рассеченного боковые ветви или неадекватной герметизации канюлю внутри артериолы. Следите за содержание внутрипросветная, оставляя судна. Меньше, менее очевидные утечки могут проявиться со временем по мере падения давления на манометр. Если возможно загородить открытия с дополнительные Вольфрам проволока скользит, стараясь не нарушить канюли. Препараты с очевидным утечки исключите из дальнейшего анализа. Применять препарат abluminally интерес к судна до, или после, герметизация 15 мин в зависимости от целей эксперимента (бывший позволяет воздействие на развитие миогенных тона определяется, в то время как последний позволяет анализ воздействия на стационарном тон миогенных). Система доставки типичных наркотиков изображен на рисунке 3A. Расположите выходу доставки перпендикулярно часть судна интерес (как показано на рис. 1 d) на расстоянии ~ 500 мкм от судна интерес, принимая меры к тому, что розетки оптимально под углом до полностью superfuse области (см. Рисунок 3B). Убедитесь, что изменения в перфузии не беспокоить физически судна. После завершения эксперимента применить раствор 0Ca2 + Hanks, содержащий 10 мкм Вортманнин (ингибитора киназы лёгкие цепи миозина) чтобы максимально расширить судна для определения пассивный диаметр.Примечание: Численность катетеризации уплотнение может быть проверена по завершении эксперимента повышение давления внутрипросветная для > 100 мм рт.ст.. Большинство судов будет оставаться прикрепленной даже на этот высокого давления, указывающее герметичное уплотнение. Следует провести автономный анализ с помощью обнаружения края для отслеживания изменений артериол диаметром (см. Таблицу материалы для предлагаемой программы). Нормализовать противовоспали диаметром до пассивный для сравнения между судами. 3. Ca2 + изображения Примечание: Изолированные артериол сетчатки готовятся для обычных (microfluorimetry) и конфокальный Ca2 + изображений как следующим образом (с помощью оборудования, подробно изложены в Таблице материалов). Подготовьте сетчатки гомогенатах в 5 мл стеклянной испытательной трубке, как описано в разделе 1. К 1 мл сетчатки огневки добавить фура – 2 утра (microfluormetric Ca2 + запись) или Fluo – 4 утра (конфокальный Ca2 + изображений), дать окончательный концентрации 5 мкм (защищает от света); краситель показатели нагрузки преференциально в гладкомышечные клетки. Сохранять при комнатной температуре в темноте за 2 ч, стряхивая стороне трубки каждые 15-20 мин вновь приостановить ткани сетчатки. После этого развести 1:4 огневки LCH решение для дальнейшего сокращения красителя загрузки.Примечание: Судов остаются жизнеспособными в течение до 6 ч (при хранении при температуре 4 ° C и в темноте); Однако это рекомендуется, что эксперименты начался как можно скорее для уменьшения последствий разобщенности красителя в внутренней органеллы или экструзии красителя с течением времени. Передача 1-2 мл сетчатки огневки прозрачным дном записи камеру (частично заполнены с LCH) смонтированы на сцене инвертированным микроскопом, подключенный к Ca2 + microfluorimetry или система конфокальной микроскопии. Якорь артериол, перпендикулярно к направлению потока через запись камеры с Вольфрам проволока скользит (50 мкм диаметром, 2-4 мм в длину) на расстоянии ~ 100-200 мкм друг от друга по длине судна (см. рис. 3 c) использование подобную технику, описанной на шаге 2.3. Perfuse Ванна с нормальной Ca2 + Hanks раствор при 37 ° C. Позиция на выходе доставки наркотиков как показано на рисунке 3 c и применять препараты к судам, как описано в шаге 2.17. Для обычных Ca2 + изображений, освещают судно с 340/380 Нм света через объективной погружения УФ нефти (например, 100 X, NA 1.3) и собирать испускаемого флуоресценции в 510 нм через Фотон подсчета фотоэлектронный умножитель трубки (ПЛТ). В конце каждого эксперимента, измерить фон флуоресценции закалки сосуд с раствором НКД содержащих (см. таблицу 1). Использовать фон исправлены флуоресценции соотношения (R-F340/F380) для анализа или преобразовать в внутриклеточного Ca2 + ([Ca2 +]i) с использованиеммин R и RМакс измерений (см. таблицу 1; прикладная перед закалкой 24) и Grynkiewicz уравнение25. Для конфокальный Ca2 + изображений, возбуждают Fluo-4 загрузки судов на 488 нм и захвата результирующая флуоресценции выбросов на 490-535 Нм в любой строке сканирования режим (xt) или xyt режимы сканирования (512 x 512 пикселов; предлагаемые обскуры 300 Нм). Нормализовать измерения флуоресценции, записанная в момент времени t = 0 (0F/F). Оценить изменения в [Ca2 +]i во время применения препарата или герметизация автономно в конкретных регионах интереса (ROI) с помощью программного обеспечения для анализа изображений. При необходимости выполните Ca2 + изображений с давлением миография.Примечание: Выше описания были оптимизированы для судов, не под давлением; Однако это можно объединить Ca2 + изображений с давлением миография следующим образом. Изолируйте артериол в соответствии с разделом 1. Загрузить с Ca2 + индикатор красители согласно шаг 3.1-3.2. Передать запись камеры артериол и иглу в соответствии с разделом 2. Позаботьтесь, чтобы ограничить воздействие света во время процедуры установки. Измерьте Ca2 + согласно шаг 3.5 или 3.7 выше. Давление на судно и повторите измерение Ca2 +. Одновременное измерение диаметра сосуда зависит от режима Ca2 + измерение и используемого оборудования.Примечание: Для конфокальный Ca2 + измерение он может потребоваться герметизация до и после изображения отдельных регионов вследствие обесцвечивания краски во время длительного воздействия на свет. 4. патч зажим электрофизиологии Примечание: Поклеточного и канальные запись возможна от индивидуальных артериол гладких мышечных клеток еще встроенный внутри их родительского артериол следующим образом (с помощью оборудования, подробно изложены в Таблице материалов). Изолировать и якорь артериол сетчатки в зале записи, как описано в шагах 1, 2,3 и 3,3. Для записи патч зажим, Вольфрамовая проволока скользит, расположенными судна 200-800 мкм друг от друга. Удаление базальной пластинки, окружающих артериолы и электрически расцепить прилегающих гладких мышечных клеток и базовой эндотелиальных клеток до патч зажима. Для этого, superfuse судно с последовательный ряд ферментов решения (Таблица 1) при 37 ° C требуется время.Примечание: Длительность воздействия ферментов оптимизирована для артериол сетчатки крыс (протеазы, ~ 8 мин; коллагеназы, ~ 12 мин) и зависит от скорости потока системы доставки наркотиков (~ 1 мл/мин на нашей set-up) и мероприятий группы партии ферментов используются. Оценить уровень пищеварения на визуального разделения эндотелия и слоями гладких мышц во время коллагеназы шаг как показано на рисунке 4. После разделения слоев клеток наблюдается (как показано на рис. 4B), применять DNAse я решение (~ 4 мин) затем прекратить пищеварение путем замены раствора Ванна с нормальной Ca2 + Hanks решение. Удалите любые оставшиеся нити базальной пластинки или периферических neuropile, тщательно потрясающим закрытых советы тонкой щипцы вдоль поверхности судна. Вытяните и польские стеклянные капилляры (Таблица материалов), заливка с пипеткой раствор (Таблица 1) и место надежно в пипетку держатель патч зажим headstage. Поместите дозатор под углом 45° по отношению к записи камеры и продвигаться судна с помощью грубой настройки на моторизованных микроманипулятор. Выберите ячейку гладких мышц, торчащий из стены судна и поверхность которого является свободным от видимых мусора (см. рис. 4B). Расположите наконечник пипетки патч вертикально над ячейкой интерес и ниже, постепенно с помощью штраф/медленное движение микроманипулятор сделать контакт с мембраны гладких мышц. Оценить контакта между клеткой и пипетки визуально от клеточного движения и изменения в пипетку сопротивление измеряется с помощью протокола испытаний мембраны (печать) в приобретении программного обеспечения (5-10 mV негативным шагом от 0 mV, частота 25 кГц; см. Рисунок 5A(i)) . Когда печать сопротивления увеличилось в 5 раз (например, рост от 2 до 10 MΩ; Рисунок 5A (ii)) временно применять отрицательное давление к задней части держателя пипеткой через y разъем, 3-way кран, шприц и труб прикреплены к держателю пипетки (собраны в аналогично используемому в наддув артериол, см. рис. 1B). Повторите применение отрицательного давления до gigaseal (> 1 GΩ сопротивление; как указано мембраны тест в приобретении программного обеспечения) является сформирована (Рисунок 5A(iii)). Обратите внимание, что этот процесс может занять 1-5 мин. Если gigaseal не в форме, выберите другую ячейку для фиксации с помощью пипетки свежий патч. Применить Холдинг потенциал к ячейке через приобретение программного обеспечения в соответствии с выполняемой эксперимент (обычно 0, -40 или -80 МВ). Исследование активности одного канала (на клеток) в нынешней конфигурации. Кроме того создаваемых наизнанку патчи быстро втягивания патч пипетку из клеточной поверхности после формирования gigaseal. Свободные концы мембраны может повторно отжига в этих условиях следует удалите пипеткой из ванны через быстрое вертикальное движение манипулятора (грубая настройка). Быстро вернуться через мениска удалить реформированной мембраны, оставив только патч внутри наконечник пипетки. Установите частоту дискретизации на приобретение программного обеспечения до 5 кГц и активировать режим непрерывной записи для записи канала активности. Примените изменения напряжения, при необходимости через программное обеспечение или усилителя. При необходимости, применять препараты судно/мембраны патч как описано в шаге 2.17. Если требуется растянуть мембраны, примените отрицательное давление задней пипетки, используя шприц, придает манометр через кран 3-х и y разъем. Анализируйте одноканальной записи для открытых вероятности и унитарное проводимость в соответствии со стандартными процедурами26. Для всей ячейки текущей записи тянуть и польский пипетки согласно Таблице материалов, заполнить с пипеткой раствор, содержащий амфотерицин B (добавьте 50 мкл ДМСО 3 мг амфотерицин B; sonicate смешать и мкл 3-6 это в 1 мл раствора поклеточного пипетки) и сформировать печать согласно шаги 4.6-4.9. Благодаря включению амфотерицин B нет необходимости к разрыву мембраны в пипетку подсказка для получения клеточных доступа. Контролировать доступ, который будет накоплен постепенно, используя протокол испытаний мембраны в приобретении программного обеспечения (шаг mV-20 -40 мВ, частота выборки 25 кГц; см. Рисунок 5B). Автоматизированные установки емкостным транзиентов в некоторое программное обеспечение дает реального времени измерения сопротивления доступа и ячеек емкость (в качестве альтернативы относительный спад переходных можно оценить на глаз). Как только доступ сопротивление падает < 15 MΩ, выполните серии сопротивления компенсаций (рис. 5 c) с помощью поклеточного параметр циферблаты (емкость и серия сопротивление) на усилителе. Для этого, использовать автоматизированные установки значения для первоначально установлена циферблатами, (см. рис. 5 c(ii)), затем увеличить ручку компенсации сопротивления серии (прогноза и коррекции, если доступно на усилителе) повторная регулировка клеточных компенсаций при одновременном снижении емкостным переходные (см. рис. 5 c(iii)). Стараясь не над компенсировать (как показано на рисунке 5 c(iv)). Как правило это можно компенсировать сопротивление серии на 75% в режиме перфорированные патч (требует компенсации запаздывания на максимум). Если не автоматизированной установки доступен, начнем настройку параметров поклеточного набирает 15 ПФ и 15 mΩ (типичные значения для этих клеток), а затем настроить для достижения результатов, как показано на рисунке 5 c(ii). Увеличение компенсации сопротивления серии наберите ~ 75% и скорректировать параметры поклеточного набирает согласно рис. 5 c(iii). До начала экспериментов отметить ячейки измерения емкости первоначального автоматизированной установки или из удаленного после ручной компенсации.Примечание: Это значение используется для нормализации токов размер ячейки. Компенсация за последовательное сопротивление может потребоваться корректироваться в ходе экспериментов, как доступ может продолжать совершенствовать связи дальнейшее включение амфотерицин в патч. Применять препараты к судам, как описано в шаге 2.17. Примените напряжения протоколы (шаги или пандусы) экспериментальной требованиями.Примечание: Типичный напряжения шага протоколы, 0.1 – 1 s в продолжительности, применяются от проведения потенциал в 10-20 МВ увеличивается каждые 5-10 s производить семейство активации напряжения токов. В качестве альтернативы использовать протоколы пандус для измерения токов в серии напряжений в одном «размах» наращивает напряжение медленно (100-200 МВ/s) от например, -80 до + 80 МВ (применяется каждые 5-10 s) с автономной выборки текущего интервалом 10 МВ в ходе рампы. Это можно объединить Ca2 + изображений с патч зажим записи следующим образом. Изолируйте артериол в соответствии с разделом 1. Загрузить с Ca2 + индикатор красители согласно шаги 3.1-3.2. Смонтировать в зале записи в соответствии с разделом 4. Позаботьтесь, чтобы ограничить воздействие света во время этих процедур.Примечание: На сегодняшний день он не удалось объединить патч зажим с миография исследования давления из-за потери базальной мембраны и целостности судна во время процесса ферментативные диссоциации
Representative Results
Рисунок 6A схематическая рисунок сетчатки сосудистого дерева крыса. Диаметр диапазоны первого порядка (30-45 мкм), второго порядка (20-30 мкм) и предварительно капиллярного артериол (8-20 мкм) было подтверждено экспериментально в нашей лаборатории конфокальная томография крыса сетчатки целом гора препараты immunohistochemically помечены для актина α-гладких мышц (Рисунок 6B). После диссоциации сетчатки начального, среднего и предварительно капилляров, артериол могут быть определены на основе их калибр и расположения сосудистой гладких мышечных клеток. Первого и второго порядка артериол визуально похож по микроскопии ярко поле, но могут быть выделены на основании их размера (рис. 6 c). Предварительно капиллярного артериол являются наименьшей артериальных сосудов в подготовке и легко узнаваем, благодаря их редкой расположения сосудистой гладких мышечных волокон. Изолированные артериол могут четко отличать от капилляров и венул в изоляции. Капилляры становятся очевидными, как сеть сосудов малого калибра (4-10 мкм в диаметре), в то время как венулы тонкой стеной и отсутствие охват клетки гладких мышц (рис. 6 c). Начальное, среднее и предварительно капилляров, артериол подходят для давления миография, Ca2 + изображений и патч зажим исследований. Рисунок 7 показывает давление миография эксперимент, где основной крыса артериолы сетчатки был канюлированной и внутрипросветная давление увеличивается до 40 мм рт.ст.. Артериолы затем поддерживается на это давление, чтобы позволить для развития миогенных тон перед добавлением 0Ca2 + Hanks содержащие 10 мкм Вортманнин для получения пассивного диаметр судна. 7а Рисунок показывает микрофотографиями противовоспали в различные моменты времени в ходе эксперимента. Полный курс запись показаны изменения в диаметре судно со временем было изобразить в Рисунок 7B с помощью пользовательских сделал края обнаружения программного обеспечения27. Сразу же после наддув расширяет корабля, который затем следуют активные миогенных сужения, которое достигает уровня, установившегося после 15 минут добавлением 0Ca2 + Hanks’/ Вортманнин решение расширяет судна обратно до уровня, аналогичного тому наблюдается сразу же после этапа начального давления. Как описано выше, наркотики могут быть применены к следующей подпора для изучения механизмов, лежащих в основе развития и поддержания миогенных тон в этих судов или судов до. Используя этот подход, мы ранее показали что стрейч активированный каналы переходных рецепторов потенциал Vanilloid 2 (TRPV2) и L – и T-типа условного напряжения Ca2 + каналы играют центральную роль в содействии развитию миогенных тон в первом и второго порядка крыса артериол сетчатки20,21,22. Мы также сообщали, что что большая проводимость Ca2 + активирован калия каналы (каналы BK)19,28 Kv1-содержащих напряжения закрытый K+ каналы закон и противостоять миогенных деятельность в Эти суда, поскольку помимо конкретных ингибиторов для каждого из этих каналов вызывает вазоконстрикцию (рис. 7 c). На рисунке 8 показаны примеры обычных и конфокальный Ca2 + изображений в артериолы сетчатки до и следующие подверженности вазоконстриктора пептида, эндотелина-1 (Et-1). В обычных на основе фура-2 записи (рис. 8A), Et-1 (10 Нм) вызывает увеличение двухфазный в [Ca2 +]я в слое сетчатки артериол гладких мышц, состоящий из первоначальных переходных компонента, следуют ниже устойчивый компонент. Ранее мы охарактеризовали временной и постоянной компоненты как Ca2 + освобождение от эндоплазматического ретикулума и Ca2 + приток из внеклеточного пространства, соответственно29. На основе Fluo-4 конфокальный Ca2 + изображений обеспечивает более подробную картину последствий Et-1 на клеточном уровне. В этих экспериментах очевидно, что гладкая оцениваются изменения в глобальной [Ca2 +]я наблюдается в результате исследования нашей microfluorimetry от Et-1, стимулируя активации повторяющихся асинхронных [Ca2 +]я колебания в соседних клетках артериол сетчатки гладкие мышцы вдоль стенки сосуда (Рисунок 8B, C; 30). Рисунок 9 показаны примеры одноканальной и поклеточного патч зажим записей от сетчатки артериол гладких мышечных клеток. На сегодняшний день мы провели как на ячейки и изнутри наружу одноканальный патч зажим записи22,28. Рис. 9A, B например, показывают на ячейку фиксации записи до и следующие стретч мембрана (полученный в результате применения отрицательного давления в пипетку патч). Этот частности патч содержит два канала, которые активируются механическое растяжение. Ранее мы показали, что эти токи можно препятствует использование TRPV2 канала блокирует поры антитела22. Унитарная проводимости каналов (249.71 Л.с.) согласуется также с этих токов, при посредничестве TRPV231. Поклеточного активации напряжения токов можно вызывали с помощью протоколов шаг напряжения. Рисунок 9C показывает семье напряжения активированный A-типа K+ токов, записанные с помощью такого подхода. Эти токи становится очевидным, когда другие большие токи в эти клетки (например, BK и Ca+-активированный Cl– токов) блокируются с помощью конкретных фармакологических агентов32,33. Токи через не – или слабо напряжения зависимых каналов иона обычно рассматриваются с использованием протоколов рамп напряжения. Мы использовали такие протоколы для определения и описания TRPV2 токи, активированную гипотонический стрейч22 и канал агонистов (Рисунок 9D) в клетках артериол сетчатки гладких мышц. На рисунке 10 показан перепад давления миография и конфокальный Ca2 + томография применяется в первичной крыса артериолы сетчатки. Наддув триггеры увеличение частоты [Ca2 +]я колебаний в отдельных гладких мышечных клеток, аналогичны наблюдал с Et-1. Ранее мы показали, что эти колебания вызываются путем суммирования Ca2 + искры (локализованные Ca2 + релиз события) и способствовать поколения миогенных тон20. Рисунок 1 . Экспериментальная установка для давления миография в артериолы сетчатки крыс. A) экспериментального оборудования, включая инвертированным микроскопом, нагреватель в линии для perfusate Ванна, 3-оси механических и микро манипуляторов, манометр, канюли держателя и таблица воздуха. B) Схематическая диаграмма, показывающая оптимальное расположение cannulating пипетку и судно интерес к записи камеры. Эта схема также иллюстрирует основные настройки Оборудование наддува. Принципиальная схема C) показан процесс закрепления и перемещение корабля с помощью дополнительных Вольфрам проволока скользит в тонкой щипцами. (i) drop 1st скольжения, чтобы загородить судна. (ii, iii) Используйте дополнительные листы чтобы подтолкнуть поглощения скольжения (направление показано стрелкой) и сопровождающие судна в оптимальной ориентации, показано в (iv). D) Схематическая диаграмма, показывающая оптимальное позиционирование поглощения Вольфрам проволока скольжения, вспомогательный пипетки и канюли в отношении судна, как заказать до катетеризации. На выходе из системы доставки наркотиков располагается на расстоянии ~ 500 мкм с судна, чтобы уменьшить движение артефакты во время применения препарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 . Процесс катетеризации давления миография. A) микрофотографиями, показаны сетчатки артериолы, якорь вниз в зале записи до (i), (ii)-(v) и следующих катетеризации (vi). Голубая стрелка указывает направление движения канюли, в то время как зеленая стрелка указывает направление движения вспомогательный пипеткой. B) Микрофотография показаны оптимального региона для записи миогенных активности во время наддув как выделенные красным цветом. Обратите внимание, что регулировка света и фокус для увеличения контрастности стенок сосудов позволяет лучше отслеживать судов края для автоматизированного анализа. Шкалы бар показывает 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 . Наркотиков доставки. A) оборудование, используемое для доставки лекарств, показаны решения водохранилищ, подключенных к коллектору многоканальный доставки контролируемых 3-полосная краны и прилагается к 3-оси механический манипулятор. B) диаграмма, показывающая оптимального вертикальное расположение доставки лекарств коллектор по отношению к записи камеры. Микрофотография C) судна на якорь вниз в записи камеры показаны идеальное позиционирование на выходе доставки наркотиков. Представляет линейку 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4 . Ферментативный пищеварения артериол сетчатки для фиксации записи. Свет микроскопии сетчатки противовоспали до (A) и после (Б) ферментативного пищеварения. Обратите внимание, физическое разделение (обозначается стрелками) гладких мышечных клеток (SMCs) от базовой эндотелиальных клеток (ECs). Гладкомышечные клетки для зажима патч отмеченные звездочкой. Линейки шкалы представляет 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 . Один канал и клеточных патч зажим записи. A) Иллюстрация тест токов наблюдается во время протокол «печать тест» когда: (i) патч пипетку входит средство внешней купания, (ii наконечник пипетки соприкасается с плазматической мембраны клеток сосудистой гладкой мускулатуры и (iii) всасывания применяется к задней части пипетки для включения формирования gigaseal. После пипеткой емкостной компенсации используя патч зажим усилителя одноканальный токи теперь могут быть записаны в конфигурацию на ячейки или патч мембраны может подакцизным, быстро сняв дозатор для создания патча «наизнанку». B) текущие изменения, связанные с развитием электрической доступ в глубь клетки во время применения препарата амфотерицин B поклеточного перфорированные патч зажим техника (i): (ii) как амфотерицин B разделов в мембраны, доступ сопротивление падает и емкость транзиентов вызвало во время гиперполяризирующий шаги напряжения (от -40 до -60 МВ) становится больше; (iii) когда доступ сопротивления (R) упала до < 15 MΩ, который обычно занимает 5-10 мин после формирования gigaseal, возможна экспериментов. C) до поклеточного записи, доступ сопротивления и емкостной ячейки должны компенсироваться с помощью соответствующих набирает на патч зажим усилителя. Значения доступа сопротивления и клетки емкости, предоставляемые автоматизированных функций в патч зажим программное обеспечение может использоваться для руководства этим процессом: (i) показывает емкость переходных до компенсации взято из выделенной области в B(iii); (ii) показывает снижение емкости переходных обычно наблюдается, когда компенсируются доступ сопротивления и емкости; (iii) серии компенсация сопротивления затем должны быть исправлены до 75% и доступ к сопротивлению и емкостной компенсации доработать таким образом, чтобы результирующий переходных должно быть относительно равной амплитуды выше и ниже уровня плато ток во время шаг. (iv) следует обеспечить, что сопротивление доступ не более чем компенсируется (указывается наличие «мелодии» переходных), который иногда может произойти, если доступ продолжает улучшаться в течение эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6 . Идентификация изолированных крыса артериол сетчатки. A) рисунок, показывающий расположение крыса сетчатки микрососудистой дерева. Конфокальный изображения B) крыса сетчатки артериол и венул в плоский горе подготовки витражи для αSMA (красный ядер запятнаны синий; масштаб бары представляют 50 мкм). C) света микроскопии изолированных 1 °, 2 ° и предварительно капиллярного артериол, капиллярной сети и венулы (шкала бары представляют 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7 . Артериол давления миография записей. Изображения A) (i) показ канюлированной артериолы сетчатки отдыха диаметр (примерно 35.6 мкм), (ii) дилатация на наддув, (iii) разработка миогенных вазоконстрикцию и (iv) дилатация связано с добавлением 10 мкм Вортманнин в 0Ca2 + Hanks решение. Шкалы бар представляет 10 мкм. B) время курс участок диаметром судна для полного эксперимента показано в A (пробы на 2,5 кадров в секунду). C) диаметр след от различных противовоспали под установившегося миогенных тон (диаметр 38,7 мкм) показаны последствия Kv1 канала ингибитор correolide (10 мкм) и ингибитор iberiotoxin BK канала (100 Нм) (пробы на 0,5 кадров/сек). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 8 . Эффекты Et – 1 на [Ca2 +] я сигнализации деятельность в артериолы сетчатки крыс. A) обычных на основе фура-2 запись показаны последствия Et-1 (10 Нм) на глобальной [Ca2 +]я. Базальные [Ca2 +]я был 82 Нм в этом противовоспали 1 °. B) на основе Fluo-4 конфокальный xt изображения показаны последствия Et-1 на [Ca2 +]я на клеточном уровне. Участок C) нормализованных флуоресценции интенсивности (0F/F) измеряется в клетках, как отмечено в б. Этот показатель был изменен с Tumelty и др. 30 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 9 . Одного канала и записи поклеточного патч зажим с крыса артериол сетчатки гладкомышечные клетки. A, B) на ячейку одноканальной записи из же мембрана патч до (A) и в (B) Пипетка приложение отрицательного давления (-45 mmHg) патч. Два канала присутствуют в патч (унитарное текущего 12,81 ПА; унитарное проводимость 249.71 Л.с) которые показывают значительное увеличение в активации стрейч условиях. Отдельные регионы от верхней панели (i) показаны на более быстрое время база в нижней панели (ii). Семейство C) токов канал A-типа K+ (i) записан в режиме вся ячейка в присутствии ингибиторов BK и Ca2 +-активации ингибиторов канал Cl– , в ответ на напряжение 20 МВ по ступеням между -80 мВ до + 80 mV (ii). D) клеточных токов (i) вызвали напряжение рампы между -80 МВ и + 80 мВ до (чёрная линия) и во время применения TRPV2 канала агонист Дельта-9-тетрагидроканнабинола (Δ9-ТГК) (красная линия). Используемый протокол рамп напряжения показан на нижней панели (ii). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 10 . Ca2 + конфокальная томография до и после наддув артериолы сетчатки крыс. Представитель конфокальный xt сканирование (i) артериол сетчатки гладкомышечные клетки под (A) без давления и (B) под давлением условия, полученные от отдельных регионов того же судна. (ii) изменения в нормализованной флуоресцирования (0F/F) записанные в отдельные клетки а – е, как указано в подпункте (i), заговор против времени. Звездочки показывают, что отдельные субцеллюлярные Ca2 + искры, увеличение частоты после подпора и summate для активации клеточного Ca2 + колебания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Соединение (мм) Низкая Ca2 + Hanks 0Ca2 + Hanks Нормальный Хэнкс Изоляции фермента протеазы Изоляции фермент коллагеназа Изоляции фермента DNAse Утолить решение Решение Rmin Rmax решение Клетки придают внеклеточного решение Клетки придают пипеткой раствор Поклеточного внеклеточного решение Поклеточного пипеткой раствор Чистота воды (сопротивление) ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm NaCl 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138 D-глюкоза 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2 MgCl 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1 HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 CaCl2 0.1 2 0.1 0.1 0.1 10 2 2 2 0.2 EGTA 4 0.5 НКД 10 Ionomycin 0.01 КОХ 140 130 D-Глюконовая кислота 130 130 NaOH 10 Penitrem A 0,0001 0,0001 0,0001 4-aminopyridine 10 Нимодипин 0.01 0.01 Флуоксетин 0.1 9-anthracenecarboxylic кислота 1 Амфотерицин B 300-600 мкг мл-1 Протеазы типа XIV ~0.01% (0,4-0,6 мг/40 мл) Коллагеназы типа 1A 0,1% (6 мг/60 мл) DNAse I 20 ку (20 мкл акций 1 му/мл в 20 мл) pH 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.2 титруют с NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH Трис Трис NaOH КОХ Таблица 1. Состав растворов, используемых в эксперименты, включая примеры внешних и пипетки решений используется для одного канала (TRPV2) и клеточных токов (A-типа).
Discussion
Протоколы, описанные выше требует практики, но должны быть достижимыми с минимальными устранение неполадок. В среднем в день мы бы получить 6-8 полезная артериол от изоляции и достижения 3-4 успешных экспериментов. Если возникают проблемы, однако, есть некоторые шаги, которые могут быть предприняты, чтобы помочь улучшить показатели успеха. Иногда мы нашли, особенно при использовании молодых крыс (< 8 недель), что доходность артериол может быть низким. Чтобы обойти эту проблему, мы предлагаем, центрифугирование ткани сетчатки (10-30 s на 500 x g) между каждым из Тритурация шаги в шагах 1.12-1.14. Это часто помогает улучшить доходность судов, но также увеличит количество клеток мусора в рамках подготовки.
Когда cannulating сосудов давления миография исследований важно проверить артериол тщательно для любого боковых ветвей, которые возможно были расщепляется недалеко от раздвоения сайта. Это является распространенной причиной утечки и потери давления во время экспериментов. Главный вопрос, который может возникнуть в связи с [Ca2 +]я протоколов является уровень загрузки красителя. Бедных краситель загрузки приводит к низким соотношения сигнал шум, а перегрузка приводит к нарушению нормальной Ca2 + гомеостаза. Чтобы уменьшить вероятность возникновения любой из этих вопросов, могут быть удалены небольшой Алиготе сетчатки огневки, и изолированных судов проверяются периодически во время загрузки протокол. При проведении патч зажим эксперименты, успеха формирования gigaseal сильно зависит как хорошо базальной пластинки были осмыслены. Когда первоначально этот протокол испытания или с помощью новых много ферментов, это может быть необходимо отрегулировать концентрацию/продолжительность Пищеварение энзима. Внимательно следит за разделение слоев эндотелия и гладкой мускулатуры обеспечит достаточные пищеварение для удаления достаточно базальной Ламинальный получить доступ. Тщательный мониторинг необходим также избежать чрезмерной пищеварения, который может проявляться как судно начинает сжиматься. Если это происходит, гладкомышечные клетки часто являются слишком хрупкие для записи зажим патч. При применении ферментов, важно включить DNAse I обеспечение удаления нитей ДНК, освобожденных от поврежденных клеток во время процесса изоляции. Фрагменты ДНК липкое и вызывают щипцы придерживаться противовоспали на заключительных этапах процесса очистки (шаг 4.4), часто приводит к гибели судна. Очистка судов является технически сложным и лучше всего выполняется в большом увеличении (20 X) с нежным радикальных движений закрытых Щипцы диаметром лучших возможных подсказка. Между отчётами чистые пинцет с роликом лаборатории.
Как отмечалось ранее, основные мотивы для разработки протоколов, изложенные в этой рукописи был лучше понять, почему кровоток нарушается во время заболеваний сетчатки сосудистого. Большая часть нашей работы до настоящего времени уделялось диабетических глазных болезней28,33. Артериолы могут быть изолированы от сетчатки экспериментальных моделей грызунов диабета с помощью методов, описанных в разделе 1. При проведении экспериментов на изолированных артериол сетчатки от диабетической животных, важно, чтобы попытаться тесно воспроизвести гипергликемической условия, испытываемых судов в естественных условиях. По этой причине мы обычно бы поднять уровни D-глюкозы в нашей изоляции и экспериментальных решений до 25 мм. Утолщение мембран сосудистой подвале явление общепризнанным в сосуды сетчатки при диабете34,35. При использовании животных с длительного диабета (> 1 месяцев продолжительность болезни), увеличение фермента концентрации или пищеварения раз часто требуются для включения применения методов записи патч зажим.
Важное ограничение использования ex vivo изолированные артериол сетчатки для изучения сетчатки сосудистой физиологии и патофизиологии является потеря окружающие neuropile сетчатки. Хотя удаление глиальных и нейрональных клеток сетчатки позволяет легкий доступ для исследования физиологии клетки сетчатки сосудистого гладких мышечных клеток, ответ судов вазоактивных посредников можно резко измениться в отсутствие и наличие сетчатки ткани. Например, действия аденозин tri фосфат (АТФ), обеспечивают хорошей иллюстрацией этой точки. В изолированных крыса артериол сетчатки, добавление триггеров АТФ надежные сужение сосудов36, находясь в присутствии нетронутыми neuropile, сосуды расширяются37. Поэтому где это возможно, мы обычно пытаемся проверять основные выводы из наших изолированных противовоспали препаратов с помощью ex vivo сетчатки целом кронштейны и в естественных условиях измерений судна диаметр и крови поток16,37 . Следует отметить недавно появились новые методы для изучения малых артериол и капилляров в целом перфузии свинину сетчатки ex vivo38,39. Такие препараты способны значительно улучшить наше понимание как сетчатки neuropile регулирует сетчатки тонус артериол и капилляров и как изменения гемодинамики сетчатки модулируют активность нейронов в сетчатке.
Хотя описанные в настоящем документе ориентированы на использование изолированных крыса артериол сетчатки для понимания артериол гладкомышечные клетки физиологии, в настоящее время мы разрабатываем протоколы, чтобы также включить изучение функции эндотелиальных клеток в Эти суда. В предварительной работы мы добились успеха в изменении ферментативного пищеварения сетчатки артериол сегментов приносить трубы жизнеспособных эндотелиальных клеток, которые поддаются Ca2 + изображений и patchclamp записи исследования. Катетеризации изолированных артериол на обоих концах, позволяя внутрипросветная доставки наркотиков, могли бы в будущем также включить эндотелий зависимой сосудорасширяющих ответы должны расследоваться в этих судов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Разработка протоколов, описанных в этом документе была поддержана грантов от следующих финансовых учреждений: СИББН (BB/I026359/1), борьба за прицел (1429 и 1822), Юный Фонд исследования диабета (2-2003-525), Велком Траст (074648/Z/04), Фонд Британской сердца (PG/11/94/29169), HSC R & D Отдел (STL/4748/13) и MRC (MC_PC_15026).
Materials
| Beakers | Fisherbrand | 15409083 | Or any equilavent product |
| Curved Scissors | Fisher Scientific | 50-109-3542 | Or any equilavent product |
| Disposable plastic pipette/ transfer | Sarstedt | 86.1174 | 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture |
| Dissecting microscope | Brunel Microscopes LTD | Or any equilavent product | |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 14095 | Any equivalent fine forceps |
| Pasteur pipette | Fisherbrand | 11546963 | Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | P7741 | Or any equilavent 10cm product |
| Pipette teat | Fisherbrand | 12426180 | Or any equilavent product |
| Purified water supply | Merek | Milli-Q Integral Water Purification System | Or any equilavent system |
| Round bottomed test tube | Fisherbrand | 14-958-10 B | 5 mL; any equilavent product |
| Seratted forceps | Fisher Scientific | 17-467-230 | Or any equilavent product |
| Single edge blades | Agar Scientific | T585 | Or any equilavent product |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | Or any pliable surface |
| Testtube rack | Fisherbrand Derlin | 10257963 | Or any equilavent product |
| Pressure myography | |||
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | x2 (or any equilavent product) |
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Analysis plugin | Myotraker | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 | Custom plugin for imageJ Freely available for download |
| Cannulation pipette glass | World Percision instruments | TW150F-4 | Or any equilavent product |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fluo-4-AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #7 14097 | Any equivalent fine forceps |
| Fura-2-AM | Thermo Fisher Scientific | F1221 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Helper pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Manometer | Riester | LF1459 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W558818 | 75μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Or any equilavent product |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Video capture software | Hypercam | version 2.28.01 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Patch clamping | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve) |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200a | Or any equilavent product |
| Analogue digital converter | Axon | Digidata 1440A | Or any equilavent product |
| Collagenase Type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | 0.1mg/mL in LCH |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| DNAse I | Millipore | 260913 | Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) |
| Faraday cage | Custom made | Any equilavent commerical product | |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Patching software | Molecular Devices | Pclamp v10.2 | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Protease Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | 0.01mg/mL in LCH |
| Single channel pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| Whole cell pipette glass | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| x40 lens | Nikon | 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Ca2+ imaging | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Acquisition software | Cairn Research Ltd. | Acquisition Engine V1.1.5 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software for confocal imaging | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Confocal microscope | Leica Geosystems | SP5 | Or any equilavent product; confocal |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Monochromator | Cairn Research Ltd. | Optoscan | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Software for confocal microscope | Leica Geosystems | LAS-AF version 3.3. | Or any equilavent product; confocal |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x100 lens | Nikon | x100 N.A. 1.3 oil | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Leica Geosystems | HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D | Or any equilavent product; confocal |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x4 lens | Leica Geosystems | C PLAN, 4x/0.10, ∞/-/✝ | Or any equilavent product; confocal |
| x63 lens | Leica Geosystems | HCX PL APO, 63x/1.40 – 0.60 OIL CS ∞/0.17/E | Or any equilavent product; confocal |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Pipettes | Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation | ||
| Helper pipette | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ |
| Cannulation pipette | World Percision instruments | TW150F-4 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ |
| On-cell patching | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ |
| Whole-cell patching | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ |
References
- Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
- Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
- Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?. Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
- Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
- Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
- Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
- Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
- Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
- Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
- Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
- Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
- McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
- Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
- Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single Channel Recording, Second Edition. , 53-90 (1995).
- Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791 (2014).
- McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
- Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
- McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
- McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
- Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
- Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
- Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
- P, S. k. o. v. . J. e. n. s. e. n. ., S, M. e. t. z. . M. a. r. i. e. n. d. a. l. . P. e. d. e. r. s. e. n., Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).
Cite This Article
Curtis, T. M., McLaughlin, D., O’Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).