Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Het centrale zenuwstelsel bevat een subpopulatie van zichzelf vernieuwend, multipotente stamcellen die de capaciteit hebben om te leiden naar alle andere volwassen neurale cel typen^1,2,3,4. Deze neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in gespecialiseerde niches in de hersenen en het ruggenmerg en kan worden geactiveerd na letsel te vermenigvuldigen, migreren en differentiëren in volwassen neurale cellen. NSCs en hun nageslacht is gebleken om te migreren naar de site van de schade in^5,6van de modellen van de corticale schade. In de hersenen, NSCs gebleken voor het migreren van de laterale ventrikels op de site van schade waar ze onderscheiden in astrocyten die aan gliale litteken vorming^{7 bijdragen}. In het ruggenmerg, echter zijn weinig studies gedaan om te vragen als deze dezelfde endogene NSCs kunnen worden aangewend ter bevordering van herstel na dwarslaesie. Inderdaad, er is momenteel een debat over de vraag of de activering van de pool van de cel van de stam in het ruggenmerg een directe fysieke schade van de niche van de periventricular voering van het centrale kanaal⁸ vereist of als de schade aan de spinal cord parenchym (verlaten van de stam cel niche intact) is voldoende om te activeren van endogene NSCs⁹.

Een aantal ruggenmerg letsel (SCI) modellen zijn gebruikt om te studeren de pathofysiologie van acute en chronische blessure. Deze modellen zijn ook gebruikt om te testen potentiële therapieën voor de behandeling van SCI via neuroprotectie, Immunomodulatie en ontwikkelende cel transplantatie/vervanging strategieën^10,11,13. Huidige modellen bevatten compressie en/of kneuzingen verwondingen, die leiden grootschalige functionele tekorten evenals uitgebreide laesies en cavitations in het snoer^{14,15 tot}. Resulterende gliale littekens kunnen verschillende spinale segmenten samen met de meerderheid van de breedte/omtrek van het ruggenmerg¹⁶beslaan. Dus, terwijl deze modellen klinisch relevante zijn, zij zich veroorloven grote uitdagingen aan het bestuderen van de reactie van endogene NSCs na verwonding. Er zijn chemische modellen van schade die kan worden aangepast als u de mildere vormen van schade die het centrale kanaal¹⁷kunt sparen. Echter dit soort schade zich richten op de demyelinisatie SCI is gekoppeld en niet klinisch relevante modellen voor de fysieke en/of mechanische schade in verband met traumatische SCI.

Om de beperkingen van de huidige modellen van de schade, hebben we een naald nummer minimale SCI model, oorspronkelijk ontwikkeld in de rat⁹, voor de toepassing in een volwassen muismodel aangepast. Ons model aangepast letsel kunt maken van een consistente laesie van de dorsolateral regio van het ruggenmerg muis en sparen van het centrale kanaal op het niveau van het letsel (s). Het voordeel van dit model is dat het mogelijk de studie van NSC kinetiek maakt na letsel en hun potentiële radiale migratie op de site van letsel. Het gebruik van een muismodel staat ook het gebruik van transgene muizen waarmee lineage opvolging van endogene NSCs en hun nakomelingen na letsel. De eigenschappen van NSCs kunnen verder worden beoordeeld met behulp van een aangepaste vorm van de in vitro neurosphere bepaling die in dit protocol is opgenomen.

De bepaling van de neurosphere is een in vitro kolonievormend test waarmee de isolatie van de NSCs in aanwezigheid van mitogenen. Bij klonen plating dichtheden vermenigvuldigen individuele NSCs om te leiden tot vrij zwevende sferische kolonies van cellen die bestaan uit een kleine populaties van NSCs en een overgrote meerderheid van de progenitoren^18,19. In ons protocol, we laten zien van het isolement van twee verschillende, lineally-gerelateerde NSCs uit de streek van de periventricular van het ruggenmerg — onder basislijn voorwaarden en na onze minimale SCI-model. Definitieve neurale stengelgroenten uitdrukkelijke nestin van cellen (dNSCs) en de gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) en zijn gegroeid in aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF), fibroblast groeifactor (FGF) en heparine (samen genoemd EFH)²⁰. Deze dNSCs zijn zeldzaam in het ruggenmerg naïef, die aanleiding geven tot zeer weinig neurospheres in vitro. Echter, laten we zien dat dNSCs worden geactiveerd na minimale SCI, uitbreiding van het aantal neurospheres van de periventricular regio²¹geïsoleerd. Primitieve neurale stamcellen (pNSCs) zijn voorafgaand aan de dNSCs in de bloedlijn van neurale stamcellen. pNSCs zijn uiterst zeldzaam, express lage niveaus van de pluripotent markering Oct4, en leukemie remmende factor (LiF) responsieve²². pNSCs vormen geen neurospheres wanneer geïsoleerd van het ruggenmerg volwassen muis als gevolg van de aanwezigheid van myeline basic protein (MBP) in primaire culturen; echter pNSC neurospheres kunnen worden geïsoleerd van MBP deficiënte muizen en hun nummers zijn uitgebreide volgende schade — vergelijkbaar met dNSCs²¹. Tot slot laten we zien dat dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site van letsel bij vroege tijden na minimale SCI. Deze bevindingen tonen aan dat onze schade model en testen de kenmerken van de activering van periventricular NSCs zoals hun vermogen om te vermenigvuldigen en migreren in reactie op schade kunnen beoordelen.