قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث
Summary
نقدم هنا طريقة قوية لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الأولية في cardiomyocytes الوظيفية من خلال أوفيريكسبريشن من GATA4، Hand2، Mef2c، Tbx5، مير-1، ومير-133 (GHMT2m) جنبا إلى جنب مع تثبيط الإشارات TGF-β. يولد لدينا بروتوكول cardiomyocytes الضرب أقرب وقت توصيل بعد 7 أيام بنسبة تصل إلى 60% الكفاءة.
Abstract
ترانس-التفريق بين نوع خلية جسدية واحدة إلى آخر إمكانات هائلة لنموذج وعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان. أظهرت الدراسات السابقة أن الفأر الجنينية، يمكن برمجتها الليفية الجلدية، وأمراض القلب إلى الخلايا التي يسببها-كارديوميوسيتي-مثل الوظيفية (iCMs) من خلال overexpression عوامل النسخ كارديوجينيك بما في ذلك GATA4، Hand2، Mef2c، و Tbx5 على حد سواء في المختبر و في فيفو. ومع ذلك، أظهرت هذه الدراسات السابقة كفاءة منخفضة نسبيا. من أجل استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، يجب توضيح الآليات التي تحكم إعادة برمجة القلب لزيادة الكفاءة والنضج من iCMs.
أظهرنا سابقا أن تثبيط الإشارات برو تليفية هائلة يزيد من كفاءة إعادة برمجة. هنا، نحن بالتفصيل الأساليب لتحقيق كفاءة إعادة برمجة لتصل إلى 60%. وعلاوة على ذلك، يصف لنا العديد من الطرق بما في ذلك التدفق الخلوي والتصوير إيمونوفلوريسسينت، وتصوير الكالسيوم لقياس كفاءة إعادة برمجة ونضوج الخلايا الليفية أعيدت برمجتها. استخدام البروتوكول بالتفصيل هنا، ميكانيكية يمكن إجراء دراسات لتحديد المنظمين الإيجابية والسلبية لإعادة برمجة القلب. هذه الدراسات قد تحدد مسارات الإشارات التي يمكن استهدافها لتشجيع إعادة برمجة الكفاءة والنضج، مما يمكن أن يؤدي إلى علاجات الخلية رواية لعلاج أمراض القلب البشري.
Introduction
مرض القلب الاقفاري سبب الرئيسي للوفاة في الولايات المتحدة1. تجربة الأميركيين تقريبا 800,000 أول أو المتكررة احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن) كل سنة1. عقب مي، يضعف وفاة كارديوميوسيتيس (CMs) وتليف القلب، أودعت بتنشيط الخلايا الليفية القلب، قلب الدالة2،3. تطور قصور القلب بعد مي لا رجعة فيه إلى حد كبير نظراً لقدرة التجدد الفقراء من الكبار CMs4،5. بينما العلاجات السريرية الحالية بطء تطور المرض وتقليل مخاطر أحداث القلب المستقبل6،7،،من89، لا العلاجات عكس تطور المرض بسبب عدم القدرة على تجديد اتفاقية الأنواع المهاجرة احتشاء بعد10. تظهر الخلية رواية العلاجات لعلاج المرضى بعد “اللون مخيب للآمال”، وقد أظهرت التجارب السريرية إيصال الخلايا الجذعية للقلب بعد مي حتى الآن غير حاسمة التجدد المحتملة11،12، 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
توليد الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان المستحثة pluripotent (هيبسكس) من الخلايا الليفية التي overexpression من أربعة عوامل النسخ، تجلى أولاً تاكاهاشي & ياماناكا، فتحت الباب أمام اختراقات جديدة في خلية العلاج19. يمكن تمييز هذه الخلايا إلى كافة الطبقات الجرثومية الثلاث19، والعديد من الطرق عالية الكفاءة لتوليد إعداد كبيرة من الأنواع المهاجرة وقد ثبت سابقا20،21. CMs المستمدة من هيبسك (الوركين-CMs) يوفر منصة قوية لدراسة كارديوميوجينيسيس، وقد آثار هامة بالنسبة لإصلاح القلب بعد الإصابة. ومع ذلك، الوركين-المهاجرة تواجه حاليا عقبات متعدية الجنسيات بسبب المخاوف من تيراتوما تشكيل22، وقد تكون طبيعتها غير ناضجة برو-أرهيثموجينيك23. إعادة برمجة الخلايا الليفية في هيبسكس آثار الاهتمام في مباشرة إعادة برمجة الخلايا الليفية في أنواع الخلايا الأخرى. إيدا et al. أثبتت أن overexpression من GATA4 و Mef2c و Tbx5 (بتوقيت جرينتش) في نتائج الليفية في إعادة برمجة مباشرة إلى النسب القلب، أن كان ذلك في انخفاض كفاءة24. تم تحسين برمجة الكفاءة بالإضافة إلى Hand2 (غمت)25. ومنذ هذه الدراسات المبكرة، أثبتت العديد من المنشورات أن تغيير كوكتيل عامل إعادة برمجة مع النسخ الإضافية من العوامل26،27،،من2829، برمجة الكروماتين معدلات30،31أو32،ميكرورناس33الجزيئات الصغيرة34 يؤدي إلى تحسين الكفاءة و/أو نضوج المستحث كارديوميوسيتي مثل الخلايا (iCMs ).
ونقدم هنا بروتوكول مفصل لتوليد iCMs من الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) بكفاءة عالية. ونحن سابقا أظهر أن غمت كوكتيل هو تحسن كبير بالإضافة إلى مير-1 ومير-133 (GHMT2m)، وكذلك تحسين عند برو-تليفية إشارات المسارات بما في ذلك تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) إشارات أو المرتبطة رو البروتين كيناز (روك) مسارات الإشارات التي تحول دون35. نحن استخدام هذا البروتوكول، تبين أن حوالي 60% خلايا عن القلب “تروبونين تي” (كتنت)، أعرب حوالي 50% عن α-أكتينين، ويمكن ملاحظة وجود عدد كبير من الخلايا الضرب أقرب يوم 11 بعد توصيل لإعادة برمجة العوامل والعلاج مع TGF-β من النوع الأول مثبط لمستقبلات A-83-01. وعلاوة على ذلك، هذه iCMs التعبير عن الفجوة تقاطع البروتينات بما في ذلك كونيكسين 43 ويحمل الانكماش عفوية والعابرين الكالسيوم. تحسن ملحوظ في إعادة برمجة الكفاءة مقارنة بالدراسات السابقة وهذا يدل على إمكانية تجديد اتفاقية الأنواع المهاجرة من السكان الخلية الذاتية التي تبقى في احتشاء عضلة القلب بعد.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحدد هذه الدراسة استراتيجية ذات الكفاءة العالية لمباشرة إعادة برمجة الخلايا الليفية في iCMs الوظيفية عن طريق تسليم GHMT2m إعادة برمجة العوامل جنبا إلى جنب مع قمع برو تليفية مسارات الإشارات. استخدام التدفق الخلوي والتصوير إيمونوفلوريسسينت والكالسيوم التصوير، وضرب عدد خلايا، نعرض معظم الخلاي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث كان تدعمها أموال من المؤسسة بوتشير وارنج ويب “الطبية الحيوية برنامج البحوث”، عالم جمعية القلب الأمريكية التنمية منحة (13SDG17400031)، جامعة كولورادو قسم الطب المهني المبكر المعلقة برنامج باحث، جامعة “كولورادو شعبة من أمراض القلب بارلو نيل” الهبات، والمعاهد الوطنية للصحة R01HL133230 (إلى كانساس). A.S.R أيده المعاهد الوطنية للصحة/نكتس كولورادو كتسا المنحة رقم TL1TR001081 وزمالة قبل دكتوراه من جامعة كولورادو الكونسورتيوم التليف البحوث والترجمة (كفريت). بتأييد هذه البحوث أيضا بمنحه دعم مركز السرطان (P30CA046934)، والمنحة النوى أبحاث أمراض الجلد (P30AR057212)، وجوهر التدفق الخلوي في حرم جامعة كولورادو انشوتز الطبية.
Materials
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
- Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
- The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
- Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
- Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
- Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
- Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
- Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
- Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
- Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
- Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
- Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).
