Microscopia de luz-folha para visualização tridimensional de células do sistema imunológico humanas
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar as células imunes, incorporadas em uma matriz de colágeno (3D) tridimensionais usando microscopia de luz-folha. Este protocolo também elabora como controlar migração celular em 3D. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células na matriz 3D.
Abstract
In vivo, ativação, proliferação e função de todas as células do sistema imunológico ocorrem num ambiente tridimensional (3D), por exemplo, nos gânglios linfáticos ou tecidos. Até à data, a maioria em vitro sistemas depende de bidimensional (2D) as superfícies, tais como placas de cultura de células ou lamelas. Otimamente imitar condições fisiológicas em vitro, utilizamos uma matriz de colagénio 3D simples. Colágeno é um dos principais componentes da matriz extracelular (ECM) e tem sido amplamente utilizado para constituir as matrizes 3D. Para geração de imagens 3D, a tecnologia de microscopia de luz-folha recentemente desenvolvidos (também referida como microscopia de iluminação único plano) é caracterizada com aquisição de alta velocidade, profundidade de grande penetração, branqueamento baixa e fotocitotoxicidade. Além disso, a microscopia de luz-folha é particularmente vantajosa para medição de longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo otimizado como configurar e manipular células do sistema imunológico humanas, por exemplo, primário humanos linfócitos T citotóxicos (CTL) e na matriz de colagénio 3D para uso com a microscopia de luz-folha para a imagem latente de célula viva células assassinas naturais (NK) e amostras fixas. O procedimento de aquisição de imagem e análise de migração celular são apresentados. Especial atenção é dada para destacar os passos críticos e factores para a preparação da amostra e análise de dados. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células em uma matriz de colagénio 3D e não está limitado às células do sistema imunológico.
Introduction
Mais conhecimento sobre a migração células vem de 2D experimentos1,2,3, que normalmente são realizados em um vidro ou superfície plástica de uma cultura/imagem prato. No entanto, um cenário fisiológico requer, na maioria dos casos, um microambiente 3D, em que a matriz extracelular (ECM) desempenha um papel decisivo. ECM não só fornece a estrutura 3D essenciais para manter a morfologia celular adequada, mas também oferece sinais de sobrevivência ou pista fiável para um óptimo funcionamento de muitas células4,5 . Portanto, um ambiente 3D é necessário para melhor identificar funções celulares e comportamento em um ambiente melhor, refletindo o contexto fisiológico.
No corpo humano, a maioria das células, especialmente células imunes, exercer as suas funções sob um cenário 3D. Por exemplo, células T ativadas patrulham tecidos procura nas células-alvo, ingênuo T células migram através dos gânglios linfáticos em busca de suas células apresentadoras cognatas durante o qual o modo de migração e máquinas são adaptados para o correspondente extracelular ambiente3,6,7. O gel de colágeno 3D tem sido amplamente utilizado como um sistema celular 3D bem estabelecido e bem caracterizadas de cultura8,9,10. Nosso trabalho anterior mostra que os linfócitos humanos primários são altamente móveis e migram a uma velocidade média de cerca de 4,8 µm/min em uma matriz baseada em colágeno de 0,25%11. Rearranjo do citoesqueleto desempenha um papel fundamental na migração celular12. Acumular evidências mostra que os linfócitos não se aplicam apenas um único modo de migração, no entanto, podem alternar entre um determinado comportamento de migração, dependendo do microambiente, citocinas, localização, gradientes Quimiotáticos e extracelular sinaliza qual música o comportamento migratório em maneiras diferentes de 3.
Para confiantemente analisar funções de células imunes e comportamento, por exemplo, migração, formação de protrusão ou transporte vesicular, é de grande vantagem para ser capaz de adquirir imagens em relativamente grandes volumes 3D de forma rápida e confiável. Para geração de imagens 3D, a tecnologia de microscopia de luz-folha recentemente desenvolvidos (também referida como microscopia de iluminação único avião) oferece uma solução satisfatória13,14. Durante a aquisição de imagem, uma folha fina de luz estática é gerada para iluminar a amostra. Desta forma, sobre o plano de foco, uma grande área pode ser iluminada simultaneamente sem afetar as células do avião. Esta característica permite uma velocidade de aquisição elevado com um branqueamento e fotocitotoxicidade drasticamente reduzida. Neste artigo, descrevemos como Visualizar células do sistema imunológico humanas primárias usando microscopia de luz-folha e como analisar a migração em um cenário 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
A maioria em vitro ensaios é realizada em uma superfície 2D, por exemplo em placas de cultura de células, pratos de Petri ou em lamelas, Considerando que na vivo as células, especialmente células imunitárias, principalmente um microambiente 3D a experiência. Emergentes a evidência mostra que os padrões de migração das células imunitárias diferem entre 2D e 3D de cenários17. Além disso, os perfis de expressão de células tumorais também são diferentes em 2D e 3D-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Instituto de Hemostaseology clínica e medicina transfusional para o fornecimento de sangue de doadores; Carmen Hässig e Cora Hoxha para ajuda técnica excelente. Agradecemos a Jens Rettig (Universidade de Saarland) para o vetor modificado pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Universidade de Muenster) para a construção de LifeAct-Ruby original e Christian Junker (Universidade de Saarland) para gerar a construção de LifeAct-mEGFP. Este projecto foi financiado pelo Sonderforschungsbereich 1027 (projeto A2 para B.Q.) e 894 (projeto A1 para MH). O microscópio de luz-folha foi financiado pelo DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
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