מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש תאים חיסוניים בתוך מטריצה תלת מימדי (3D) קולגן באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. פרוטוקול זה מרחיב כיצד לעקוב אחר נדידת תאים ב- 3D. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים השעיה מטריקס תלת-ממד.
Abstract
In vivo, הפעלה, התפשטות, ותפקודו של תאים חיסוניים כל להתרחש בסביבה תלת מימדי (3D), למשל בבלוטות הלימפה או רקמות. עד כה, רוב במבחנה מערכות להסתמך על משטחים (2D) דו מימדי, כגון לוחות תרבית תאים או coverslips. מחקים בצורה אופטימלית בתנאים פיזיולוגיים במבחנה, אנו מנצלים על מטריצת קולגן 3D פשוטה. קולגן הוא אחד המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) והוא כבר בשימוש נרחב להוות מטריצות תלת-ממד. עבור הדמיה תלת-ממדית, הטכנולוגיה פיתחה לאחרונה מיקרוסקופ אור גיליונות (המכונה גם מטוס יחיד תאורה מיקרוסקופ) בהשתתפות עם מהירות גבוהה רכישה, עומק החדירה גדול, הלבנת נמוך ו photocytotoxicity. יתר על כן, מיקרוסקופ אור גיליונות הוא יתרון מיוחד עבור מדידה ארוכת טווח. כאן נתאר פרוטוקול ממוטבת כיצד להגדיר ולטפל תאים חיסוניים אנושי, למשל ראשי האדם ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) ואת הרוצח הטבעיים (NK) תאי מטריצת קולגן תלת-ממד לשימוש עם מיקרוסקופ אור גיליונות עבור הדמיה תא חי, דוגמאות קבועות. ההליך עבור ייבוא תמונות וניתוח של נדידת תאים מוצגים. דגש מיוחד ניתן להדגיש שלבים קריטיים וגורמים עבור הכנת הדוגמא וניתוח נתונים. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים ההשעיה במטריצה קולגן תלת-ממד ואינו מוגבל תאים חיסוניים.
Introduction
רוב הידע אודות מעבר תאים נובע 2D ניסויים1,2,3, אשר נערכים בדרך כלל בכוס, או משטח הפלסטיק של תרבות/הדמיה המנה. עם זאת, תרחיש פיזיולוגיים דורש, ברוב המקרים, microenvironment תלת-ממד, שבו מטריצות (ECM) ממלא תפקיד מכריע. ECM לא רק מספק הארומטיים במבנה התלת-ממדי כדי לשמור על מורפולוגיה התא הנכון אלא מציע גם אותות הישרדות או הכיוון הנכון לתפקוד אופטימלי של תאים רבים4,5 . לכן, נדרשת סביבה תלת-ממד לזיהוי טוב יותר של פונקציות תאית והתנהגות בסביבה כדאי המשקף את ההקשר פיזיולוגיים.
בגוף האדם, רוב התאים במיוחד תאים חיסוניים, להפעיל את הפונקציות שלהם תחת תרחיש תלת-ממד. לדוגמה, בתאי T מופעל סיור רקמות בחיפוש אחר התאים היעד, תמים T תאים נודדים דרך הלימפה בחיפוש אחר תאיהם אנטיגן cognate שבמהלכה מצב ההעברה, מכונות מותאמים המתאימה חוץ-תאית הסביבה3,6,7. הג’ל קולגן 3D כבר בשימוש נרחב כמו תא 3D ומבוססת, מאופיין היטב בתרבות מערכת8,9,10. העבודות הקודמות שלנו מראים כי ראשי לימפוציטים אנושיים הם ניידים מאוד להעביר במהירות ממוצעת של מיקרומטר סביב 4.8/min מבוססי קולגן מטריצה 0.25%11. סידורם מחדש של שלד התא ממלא תפקיד מפתח ההעברה תא12. לצבירת ראיות מראה כי לימפוציטים אינן חלות רק מצב אחד של הגירה עדיין יכול לעבור בין התנהגות מסוימת ההעברה בהתאם למיקום, microenvironment, ציטוקינים, מעברי צבע chemotactic, חוץ-תאית אותות איזה מנגינה התנהגות נודדים בדרכים שונות 3.
לנתח באופן אמין תא החיסון פונקציות והתנהגות, לדוגמה, הגירה, תיתכן היווצרות או תחבורה vesicular, זה יתרון גדול כדי שניתן יהיה לרכוש תמונות בכמויות גדולות יחסית 3D בצורה מהירה ואמינה. הדמיה תלת-ממדית, הטכנולוגיה פיתחה לאחרונה מיקרוסקופ אור גיליונות (המכונה גם מטוס יחיד תאורה מיקרוסקופ) מציע פתרון משביע רצון13,14. במהלך הדימות רכישה, סדין דק אור הסטטי נוצר כדי להאיר את הדגימה. בדרך זו, על מישור המוקד, שטח גדול יכול להיות מואר בו-זמנית מבלי להשפיע על התאים את המטוס. תכונה זו מאפשרת מהירות גבוהה רכישה מופחת באופן דרסטי הלבנה, photocytotoxicity. בנייר זה, אנו מתארים איך לדמיין ראשי תאים חיסוניים האנושי באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות ואיך לנתח את ההעברה בתרחיש של תלת-ממד.
Protocol
Representative Results
Discussion
רוב מבחני במבחנה מתבצעות על משטח דו-מימדית, לדוגמה-פטרי, לוחיות תרבית תאים או על coverslips, ואילו ויוו תאים, במיוחד תאים חיסוניים, לחוות בעיקר microenvironment תלת-ממד. מתעוררים ראיות מראה כי דפוסי ההגירה של תאים חיסוניים שונים בין תרחישים של 2D and 3D-17. יתר על כן, ביטוי פרופילים של ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המכון Hemostaseology קלינית ורפואה עירוי למתן דם התורם; כרמן Hässig, קורה Hoxha לעזרה טכנית מצוינת. אנו מודים רטיג ג’נס (אוניברסיטת חבל הסאר) עבור וקטור pMAX ששונה רולנד Wedlich-Söldner (אוניברסיטת מינסטר) עבור הבונה LifeAct-רובי המקורי, כריסטיאן יונקר (אוניברסיטת חבל הסאר) ליצירת הבונה LifeAct-mEGFP. הפרויקט מומן על ידי 1027 Sonderforschungsbereich (פרוייקט A2 כדי B.Q.) ו- 894 (פרוייקט A1 מ. ה). מיקרוסקופ אור גיליונות מומן על ידי DFG (GZ: מוסד 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
