Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비
Summary
미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
Tardigrades는 ametabolic 상태가 물 제공 이라고 anhydrobiosis 건조 및 수를 직면 하는 때 그들의 원래 상태로 돌아가기 현미경 동물 이다. Tardigrades 위험 세균 오염 때로는 같은 미세한 동물의 게놈 시퀀싱이이 동물에서 수평 한 유전자 이동의 범위에 관한 예를 들어 잘못 된 해석에 지도 한다. 여기, 우리는 하나의 견본에서 tardigrade, Hypsibius dujardini의 게놈을 시퀀싱 하는 ultralow 입력된 방법을 제공 합니다. 50의 효율적인 추출 함께 엄격한 세척 및 오염 물질 제외를 채용 하 여 ~ 한 개인에서 200 pg genomic DNA, 우리 건설 DNA 시퀀싱 장비 시퀀싱 라이브러리. 이러한 라이브러리 높은 재현성 및 편견, 그리고 다른 H. dujardini 유전자와 시퀀스 읽기의 정보학 분석 오염의 최소한의 금액을 보여주었다. 이 메서드는 이전 방법을 사용 하 여 시퀀싱 할 하지 unculturable tardigrades을 적용할 수 있습니다.
Introduction
Tardigrades는 건조를 직면 하는 때 anhydrobiosis를 호출 하는 ametabolic 상태를 입력할 수 있는 미세한 동물 이다. 그들은 물1,2의 흡수에 의해 복구. Tardigrades는 ametabolic 상태에서 다양 한 극한 환경 극한의 온도 압력3 4,5, 자외선 빛6, x-레이, 그리고 감마선의 높은 복용량을 포함 하는 견 뎌 할 수 있다 7 , 8, 그리고 우주 공간9. 게놈 데이터는 anhydrobiosis의 분자 메커니즘의 연구에 대 한 필수적인 기초.
Tardigrades의 게놈을 시퀀싱 하는 이전 시도 세균 오염10,11,12,,1314의 흔적으로 나타났습니다. 같은 작은 유기 체에서 게놈 시퀀싱 동물의 많은 수를 요구 하 고 세균 오염; 하는 경향이 따라서, 우리는 오염15의 위험을 최소화 하기 위해 tardigrade, 단일 표본에서 시작 하는 ultralow 입력된 메서드를 사용 하 여 연속 프로토콜을 설치 이전 했다. 이러한 데이터를 사용 하 여 높은-품질 resequencing 및 리어셈블리 H. dujardini16,17의 게놈의 더 실시는 우리. 여기 우리가 자세하게에서 게놈 시퀀싱 한 tardigrade 개인 (그림 1에서이 방법을 설명). 이 시퀀싱 방법의 유효성 검사는이 문서의 초점을 넘어 이며 우리의 이전 보고서16이미 철저 하 게 논의 했다.
이 메서드는 두 부분으로 구성: 단일 tardigrade 오염 가능한 낮은와 DNA 그림 수준의 높은 품질 추출의 분리. tardigrade 굶 어 하 고 항생제로 서 물, 철저 하 게 씻어 서 이며 어떤 세균 오염 든 지의 제거를 보장 하기 위해 500 X 확대와 함께 현미경 관찰. 이전 견적 및 측정 tardigrade의 단일 개인 게놈 DNA16, freeze-thaw 주기 또는 수동 균질 키 틴 질 외 골격을 크래킹에 의해 추출 되는 약 50-200 pg 포함 되어 있음을 표시 합니다. 이 게놈 DNA 도서관 건설에 제출 하 고 DNA 시퀀싱 장비에서 시퀀스. 추가 정보 분석 고급 시퀀싱, 뿐만 아니라 오염 이전 tardigrade 시퀀싱 프로젝트에 비해 낮은 수준으로 표시 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세균성 오염 미세한 생물의 게놈 시퀀싱에 위협이 포즈. Tardigrade 게놈 시퀀싱에 대 한 이전 연구는 오염 광범위 한 정보학 방법을12,20를 사용 하 여 필터링 하는 동안 우리는 오염 위험을 최소화 하기 위해 하나의 개별에서 게놈 시퀀싱. 개별 tardigrade genomic DNA16 의 약 50-200 pg 포함 되어 있기 때문에 키 틴 질 외 골격의 두꺼운 층에 쌌 다,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 노조미 아베, 타 카 유키, 그리고 Nahoko이 시이 게놈 시퀀싱에 그들의 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 선진적인 일본 사회에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구원, 젊은 과학자 (No.22681029), KAKENHI 특정 한 KAKENHI 특정에 대 한 과학적 연구 (B), 제 17 H 03620는 JSP에서 여는 스미 토모 재단 (No.140340)에서 그리고 야마가타 현 쓰루 오카 시, 일본에서 연구 기금에 의해 부분적으로 기본적인 과학 연구 프로젝트에 대 한 그랜트. tardigrades를 피드 하는 데 사용 되는 클로렐라 vulgaris 클로렐라 산업 주식회사의 제공 했다
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
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